外泌體在系統性紅斑狼瘡中的研究進展①

向清勇 萬偉國 劉佳滟 王令彪 鄒和建 楊 雪

(復旦大學附屬華山醫院風濕免疫科，復旦大學風濕免疫過敏性疾病研究中心，上海200040)

外泌體(Exosomes)是一種能被細胞主動分泌到胞外的微小囊泡，可存在于血液、尿液、唾液以及乳汁等多種體液中，其直徑約為30～100 nm，密度為1.13～1.21 g/ml，外泌體表面具有脂質雙層膜結構并內含細胞特異性的蛋白、脂質和核酸等生物活性物質，能保護其包被物質的同時，也能靶向特定的組織和細胞發揮其生物學功能[1]。同時不同細胞分泌的外泌體具有不同的組成成分并發揮不同的功能，可作為細胞間通訊、疾病治療的重要載體以及疾病診斷和預后的重要標志物。

1 外泌體的形成過程、表面標志及功能

首次關于外泌體的報道是1983年Pan等[2]在羊的成熟網織紅細胞中發現該細胞可釋放的一種膜性小囊泡，最初這種小囊泡被認為是用來排出多余的轉鐵蛋白受體。1987年[3]這種小囊泡被命名為外泌體，進一步的研究提示其由胞內途徑生成，目前較為公認的外泌體形成過程是細胞內陷形成早期胞內體，在內吞體轉運復合物(ESCRT)及相關蛋白的調控下，早期胞內體的界膜多處凹陷，向內出芽形成管腔狀囊泡，進而轉變為亞細胞結構的多泡小體(MVBs)，MVBs最后在膜轉運相關蛋白(GTPase)家族中的RAB酶的調節下與胞膜融合以出芽方式向胞外釋放形成外泌體[4,5]。

外泌體幾乎可以由所有種類的細胞分泌，并存在于人體各種體液之中，包括血液、尿液、唾液、乳汁等，外泌體可通過膜轉運相關蛋白GTPases、CD63、CD81及CD82等作為體外檢測及篩選的指標。外泌體中還富含微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)及蛋白等[8]。

2 不同免疫細胞來源外泌體的研究

免疫細胞作為機體發揮免疫功能的重要載體，傳統認為主要通過細胞接觸及細胞因子及抗體分泌等機制發揮調節作用，隨著近年來對細胞外泌體及其作用的逐漸認識，免疫細胞的作用機制也得到了更新和發展。

2.1 固有免疫 固有免疫細胞主要包括單核巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞(DC)及NK細胞等。目前研究較多的是巨噬細胞和DC細胞來源的外泌體。細菌感染后的巨噬細胞來源的外泌體具有免疫調節作用，其分泌的外泌體可刺激巨噬細胞及中性粒細胞分泌TNF-α、RANTES等促炎因子[9,10]；并通過TLR途徑刺激受體細胞[11]。人巨噬細胞分泌的外泌體攜帶合成白三烯B4和白三烯C4酶，可促進粒細胞的遷移[12]；而LPS刺激巨噬細胞產生的外泌體能有效減輕完全弗氏佐劑(CFA)注射后的小鼠足掌腫脹及減輕CFA誘導的炎性疼痛相關的熱痛覺過敏[13]，發揮抑炎作用；中性粒細胞來源的外泌體能迅速被氣道平滑肌(Airway smooth muscle,ASM)細胞內化，并改變其增殖特性；被LPS刺激后的中性粒細胞來源的外泌體可增強ASM細胞的增殖，導致病情加重和對激素不敏感哮喘患者的氣道重塑[14]。DC來源的外泌體可以被上皮細胞吸收，并且促進上皮細胞分泌炎癥介質(MCP-1、IL-8、TNF-α、RANTES)的釋放，提示外泌體促進免疫炎癥反應[15]；同時有研究顯示DC可通過其衍生的外泌體抑制小鼠膠原誘導性關節炎(CIA)的發生并降低其嚴重性，主要通過產生indoleamine 2,3-dioxygenase(IDO)和IL-10 發揮免疫抑制作用[16,17]；提示同一細胞來源的外泌體在不同的微環境中發揮不同的免疫調節作用，外泌體也是一把“雙刃劍”，需要我們在不同的疾病和不同的微環境中對其功能進行認識，不能一概而論。

2.2 適應性免疫 適應性免疫細胞主要包括T、B淋巴細胞。傳統認為參與細胞免疫的T淋巴細胞主要通過分泌細胞因子(IFN-γ、IL-13、IL-17、IL-21)發揮免疫調節作用；現有研究表明，在T細胞中，Wahlgren等[18]證實被相關抗體(IL-2、anti-CD3、anti-CD28)刺激的T細胞所產生的外泌體可作為自身信號物質調節初始T細胞的分化，用自身外泌體刺激的初始T細胞可導致CD4+T的增加、CD8+T的降低；T細胞產生的富含microRNA的外泌體可單向轉移至B細胞和抗原提呈(APC)細胞中，其中由MHC Ⅱ類分子參與形成的免疫突觸在此過程中發揮重要作用[19]，而CD8+T細胞分泌的表達FasL的外泌體對腫瘤細胞的凋亡和增殖影響不大，但可通過Fas/FasL途徑促進B16和3LL癌細胞的體外侵襲[20]。調節性T細胞(Treg)是目前研究相對較多的T細胞亞群，研究表明Treg來源的外泌體表達免疫調節分子(CD25、CD73、CTLA4)，具有免疫抑制作用，可以調節效應T細胞的增殖和細胞因子的分泌從而調節免疫應答[21]。Okoye等[22]研究表明Treg來源的外泌體及其中的let-7d基因能夠抑制Th1細胞的增殖和IFN-γ的分泌。抑制性T細胞來源的外泌體通過抑制效應性T細胞的增殖和誘導調節性T細胞影響巨噬細胞，其中活性氧中間體(ROI)參與了抗原特異性耐受機制[23]；而Th17細胞及濾泡輔助性T(Tfh)細胞來源的外泌體研究目前尚未見相關報道，有待進一步的研究。

B淋巴細胞主要通過分泌抗體來實現其體液免疫的調節功能，現有的研究表明B淋巴細胞可釋放表達MHCⅠ類分子和MHCⅡ類分子、CD80、CD86、CD54的外泌體，與抗原提呈相關分子有著同樣的功能，可將抗原提呈給淋巴細胞，實現CD4+T細胞的激活[24]；而人類B細胞衍生的淋巴母細胞系(Lymphoblastoid cell lines,LCL)可組成性地產生MHCⅡ+FasL+表達的外泌體誘導CD4+T細胞的凋亡[25]?？傮w來說，B細胞來源的外泌體表達及功能的相關研究目前仍較有限，有待進一步的研究及應用。

現有的研究結果表明，對T、B淋巴細胞分泌的外泌體及其功能的研究較為有限，尤其結合到某一個具體的自身免疫性疾病，T、B淋巴細胞分泌的外泌體對淋巴細胞本身的自分泌及對全身其他免疫細胞及靶細胞的旁分泌作用如何？有多大程度參與及發揮免疫作用？以及對疾病的調節作用及作用機制如何？仍有待于進一步的探索和研究。

3 外泌體在系統性紅斑狼瘡中的相關研究

系統性紅斑狼瘡是臨床常見的自身免疫病，其發病機制尚未完全清楚，但機體中的淋巴細胞存在明顯的紊亂。在SLE中，凋亡小體清除能力的缺陷和代謝產物的累積是自身抗原的主要來源[26]，特異性的外泌體及其內含物質作為SLE病情活動和預后進展的生物標志物，在系統性紅斑狼瘡的研究中得到越來越多的關注和重視。

現有研究表明，SLE患者中外泌體水平顯著高于健康人群，且SLE患者的外泌體能夠在體外Toll樣受體存在的條件下促進 IFN-α、TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，缺乏外泌體的SLE患者血清或者外泌體被破壞后則不能促進細胞因子的產生，提示血清中外泌體水平升高且可作為狼瘡活動度的指標[27]，同時，也提示我們外泌體參與了細胞因子的產生和釋放；Nielsen等[28]的研究顯示內皮細胞來源的囊泡數量與狼瘡的疾病活動度、腎小球腎炎和血管功能異常密切相關，內皮來源囊泡的表型可作為狼瘡相關血管病變的特異性生物標志；Parker等[29]的研究進一步證明使用免疫抑制治療后可減少循環中內皮細胞來源的囊泡數量并降低心血管疾病的風險，但內皮來源的囊泡本身是否也參與了這些靶細胞和靶器官損傷值得進一步的研究；Ostergaard等[30]的研究則提示在狼瘡患者外周血中存在特殊的囊泡譜，與正常人或類風濕關節炎患者比較具有差異且存在微管和細胞骨架成分減少，但這些特殊的囊泡的來源細胞目前也尚不明確；Nielsen等[31]證實狼瘡患者循環中的外泌體IgG、 IgM、 C1q的表達比健康人外泌體中的表達有所增加，并且與血漿 IgG、 抗dsDNA抗體、 抗ENA抗體、抗組蛋白抗體的濃度及低水平的白細胞呈正相關，因此認為外泌體是SLE自身免疫性抗原的來源之一，更有效地引起相應抗體的產生，參與SLE的發病機制并調控疾病活動性。除外泌體本身，其中富含的并且被轉移至細胞外的miRNA、lncRNA和蛋白成分，也可作為評估臨床疾病的有效指標；據報道miR-146a在狼瘡患者PBMCs、血漿和血清中均低表達，可能有助于SLE患者的1型干擾素(IFN)途徑的改變[32-34]，但在LN患者的腎小球組織中miR-146a則高表達[35]。

狼瘡性腎炎(LN)是臨床SLE的常見并發癥，腎臟受累的患者中有10%～30%可進展為終末期腎病[36]，因此，研究新的生物標志物早期評估腎小球損傷，避免有創活檢已經成為臨床亟待解決的問題。尿液是新型生物標志物的理想生物液體，Pisitkun等[37]對尿液中的外泌體進行鑒定和表型分析，證實尿液外泌體可作為穩定的miRNA生物標志物的來源。Solé等[38]研究發現尿液外泌體中MiR-29c的水平和LN患者腎臟病慢性化指數呈負相關，但是與腎功能指標無明顯相關性，這一發現為LN患者提供了一個預測腎臟纖維化進程的非侵入性指標的可能，亦有研究表明成熟miRNA在尿液外泌體中的分布高于尿液的其他成分；同樣miR-146a也受到了研究者關注，研究表明活動期狼瘡腎炎患者尿液外泌體中miR-146a表達明顯升高；另在腎小球疾病及LN患者的尿液外泌體中發現黏附分子ADAM10的蛋白水平較高，可作為早期腎小球疾病的生物學標志[39]。

盡管近年來外泌體在狼瘡中的研究有一些新的進展，但仍較有限；已有的研究主要把外泌體作為評估疾病活動度及腎臟受累的指標。但隨著研究的進展，我們發現外泌體不僅僅作為疾病活動和臟器受累的指標，它同時也是疾病發生發展中的重要調節因子和/或致病因子，借助其可通過體液循環到達全身的特點，在不同的微環境下發揮不同的生理/病理、促炎/抑炎的雙向調節作用。而在以免疫功能失調為疾病特點的系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病中，外泌體作為新的治療載體或靶點具有良好的前景和潛力，值得進一步的關注和探索。

4 結語

目前，外泌體在腫瘤、炎癥等方面的研究較多，但在系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病中的研究仍較有限?，F有的研究結果表明，外泌體在疾病預測、靶向治療等方面具有很大的潛能，外泌體中的相關物質如miRNA等也可作為病情預警、診斷、評估的重要指標以及有望作為后續治療的可靠載體。但外泌體確切的病理生理功能及其作為治療靶點的作用和機制需要進一步的研究闡明及驗證。研究的最終目的是將外泌體應用于臨床，因此需要更優化的細胞來源及更安全有效的治療性外泌體及外泌體成分。希望通過對外泌體研究的不斷深入，為系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的診斷和治療提供更多的選擇和幫助。