LncRNA CASC2靶向miR-634表達抑制神經膠質瘤細胞的生物學行為①

劉 露 楊福兵 朱明建 徐有臨

(西南醫科大學附屬醫院神經外科，瀘州646000)

神經膠質瘤是發生于神經外胚層的惡性腫瘤，據最新統計，我國膠質瘤的發病率從1973年的5.9/10萬上升到2016年的6.61/10萬[1]，目前研究表明，神經膠質瘤的發病與抑癌基因的失活、氧化應激損傷、遺傳基因突變和細胞自噬抑制有關，但具體發病原因及其機制尚不明確[2]，因此迫切需要闡明膠質瘤的病因及其可能的機制，并找到更有效的診療策略。 近年來，全基因組轉錄研究發現，只有大約1%的人類基因組作為蛋白質的藍圖，而更大比例的基因組被轉錄為非編碼RNA[3]。長非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是非蛋白質編碼轉錄本長度超過200個核苷酸(nt)，已證實LncRNA在各種人類腫瘤的進展中充當關鍵分子[3]。如Cancer susceptibility candidate 2(CASC2)是位于染色體10q26的LncRNA，最初被鑒定為子宮內膜癌的下調基因，并且也充當腫瘤抑制基因[4]。越來越多的研究表明CASC2的上調，可明顯抑制惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移[5]。Huang等[6]研究表明，CASC2在結腸癌中呈低表達狀態，增加CASC2的表達可以通過抑制miR-18a的表達，進而抑制JAK2/STAT3通路的激活，從而抑制結腸癌細胞的惡性生物學行為，并且CASC2的表達與臨床分期及淋巴結轉移密切相關[6]。可見CASC2可能是治愈惡性腫瘤的重要靶點，然而關于神經膠質瘤中CASC2的表達水平以及其是否參與膠質瘤形成，知之甚少。因此我們研究CASC2在神經膠質瘤患者體內表達水平與疾病分期的關系，通過構建CASC2過表達載體，研究CASC2對膠質瘤細胞的增殖、侵襲和轉移的影響，并對其可能的機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 收集2017年1月至2018年6月在我院行神經膠質瘤切除術患者的腫瘤組織18例及其病例資料，術后病檢均證實為神經膠質瘤，并且取同時期腦外傷及癲癇手術中切除的腦組織18例作為對照組，取材大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，取材后立即將標本放入液氮罐中保存，直至提取RNA。術前所有患者未經放療及化療，術前患者均簽署研究知情同意書，本研究經我院倫理委員會審批通過。

1.1.2 試劑 Lipofectamine-2000、RPMI1640細胞培養基、胎牛血清購于美國Invitrogen公司，Matrigel基質膠購于美國B&D公司，雙熒光素酶實驗試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑、熒光素酶報告基因載體psi-CHECK載體購于美國Promega公司，RNAiso Plus購于日本TaKaRa公司。CCK-8試劑盒、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、高靈敏ECL化學放光試劑盒購于上海碧云天公司。人膠質瘤細胞A127、U251、U87、正常人星形膠質細胞系HA及人腎上皮細胞HEK293細胞均購于中科院上海細胞庫。人表皮生長因子受體(Epi-dermal growth factor receptor，EGFR)、p-AKT、PI3K、GAPDH抗體均購于美國Abcam公司，IgG二抗購于上海碧云天，CASC2 mimics、CASC2-NC mimics、miR-634 mimics、miR-NC mimics 購于蘇州吉瑪制藥公司，miR-634啟動子的野生型和突變序列由上海生工合成，并連接到pcDNA3.1質粒上。突變質粒構建試劑量盒QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit購于美國CA公司。Transwell小室購于美國康寧公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 A127、U251、U87和HA細胞在補充有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養，溫度為37℃，并控制CO2濃度為5%。將細胞傳代培養至第3代，以70%～80%的密度接種于培養基中。根據轉染手冊，使用Lipofectamine-2000將miR-CASC2 mimics轉染至U87細胞，并將CASC2-NC mimics轉染至U87細胞中作為對照組1；再將miR-634 mimics轉染至U87細胞，并將miR-NC mimics轉染至U87細胞中作為另外對照組2。

1.2.2 RNA提取和實時定量PCR 根據RNAiso Plus操作說明書提取并擴增總RNA，并使用RNA逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，得到cDNA模板，將10 μl qPCR混合物及每種引物0.5 μl混合均勻，配制成最終的20 μl反應混合物。用于擴增的熱循環參數如下：94℃變性2 min；94℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 30 s，40個循環；25℃ 5 min終止反應，構建熔解曲線并在62℃和95℃之間進行分析，使用2-ΔΔCT法計算靶基因的相對表達水平。實驗重復3次。本研究中使用的引物如下：CASC2上游引物，5′-GAGGAGCCATCCGCACATCACAAT-3′,下游引物5′-AG-CTTAGACTGTAAGCTGGTCTCA-3′;U6內參上游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,下游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;miR-634上游引物：5′-CCUUCAAUUUGACCGUCCU-3′,下游引物：5′-AAU-AAAACCAGGUCGAAUAGGU-3′;β-actin上游引物：5′-CCACACCTTCTACAATGAG-3′,下游引物5′-ATAGCACAGCCTGGATAG-3′。

1.2.3 雙熒光素酶活性測定 為了確定CASC2與miR-634的調控關系，使用TargetScan(www.targetscan.org)和Starbase(starbase.sysu.edu.cn)數據庫預測其靶基因，并發現兩者具有互補的結合位點。從正常人基因組DNA擴增含有CASC2互補位點的miR-634 3′UTR序列，并克隆到psi-CHECK載體中，將該結合位點作為野生型miR-634 3′UTR。使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit產生突變型miR-634 3′UTR重組質粒。在轉染不同質粒組合后48 h，根據說明使用雙熒光素酶測定試劑盒檢測熒光素酶活性，共轉染的海腎熒光素酶質粒用作確定轉染效率的內部對照，使用雙熒光素酶報告分析系統(Promega)檢測熒光強度。實驗重復3次。

1.2.4 免疫蛋白印跡實驗 根據說明使用總蛋白質提取試劑盒提取總蛋白質，并測定每個樣品中的蛋白質濃度，通過SDS-PAGE分離后，將蛋白轉移至PVDF膜中，使用BSA封閉液封閉1 h，EGFR(1∶1 000)、p-AKT(1∶2 000)、PI3K(1∶1 200)、GAPDH(1∶2 000)4℃孵育過夜后，TBST溶液洗膜3次后，在室溫下孵育二抗(1∶10 000)1 h。使用ECL顯影液檢測EGFR、p-AKT和PI3K蛋白的表達水平，GAPDH作蛋白內參對照。實驗重復3次。

1.2.5 CCK-8細胞增殖活性測定 將指數生長的U87細胞(5×105個/ml)接種到96孔板，然后分別將細胞培養72 h，加入10 μl/ml CCK-8溶液，然后在37℃、5%CO2下孵育4 h。使用酶標儀在490 nm波長下測量細胞在48 h的OD值，細胞活力(%)=[OD(實驗組)-OD(空白)]/[OD(對照組)-OD(空白)]×100%。實驗重復3次。

1.2.6 Transwell遷移和侵襲實驗 將200 ml含細胞的培養基(1×104個)接種到每個Transwell的上部隔室中，并在37℃下孵育24 h，使細胞通過多孔膜遷移。孵育24 h后，殘留在腔室上表面的細胞被完全去除，而膜的下表面用4%多聚甲醛固定20 min，然后在0.5%(w/v)結晶紫溶液中染色5 min，洗滌后，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測定不同組別中的細胞數。侵襲實驗前預先用40 ml Matrigel基質膠在4℃條件下過夜融化,并與3倍體積的無血清培養基混合均勻后加入24孔Transwell小室(每孔50 μl)，其余實驗步驟及方法同遷移實驗。實驗重復3次。

2 結果

2.1 CASC2的表達與神經膠質瘤患者病理分期相關以及淋巴結轉移呈負相關 我們收集整理18例神經膠質瘤患者相關臨床資料進行對比分析，見表1。結果發現CASC2的表達與年齡、性別(P>0.05)。CASC2的表達與神經膠質瘤的病理分期相關以及與淋巴結轉移呈負相關，神經膠質瘤病理分期越高，CASC2在神經膠質瘤組織中表達水平越低(P<0.05)，并且在發生轉移的患者中CASC2的表達水平明顯降低(P<0.05)。

2.2 CASC2在膠質瘤組織及A127、U251、U87、HA細胞系中表達降低 實驗結果發現，神經膠質瘤中CASC2的表達較外傷及癲癇組織降低(P<0.05，圖1A)。CASC2在A127、U251、U87細胞系中表達降低，并且在U87細胞系中降低最為顯著(P<0.05,圖1B)。因此選取U87進行后續實驗研究。

2.3 CASC2可靶向下調U87細胞系中miR-634的表達 實驗結果發現，神經膠質瘤組織中的miR-634的表達含量較對照組織降低(P<0.05，圖2A)。miR-634在A127、U251、U87細胞系中表達同樣降低(P<0.05,圖2B)。雙熒光素酶報告基因結果顯示，與對照組相比，CASC2 mimics與miR-634 3′UTR Wt共轉染的HEK293細胞中miR-634的表達活性明顯降低(P<0.05，圖2D)。

表1 CASC2表達與神經膠質瘤患者臨床病理特征的關系

Tab.1 Correlation between expression of CASC2 and clinicopathological features of Glioma

Clinicopathological datanCASC2 relative expressionP valueAge(year)0.642≤40100.62±0.18>4080.59±0.14Gender0.315Male90.60±0.17Female90.68±0.16Pathological stage0.001Ⅰ-Ⅱ61.28±0.25Ⅲ-Ⅳ120.32±0.11Lymphatic metastasis0.002-130.80±0.15+50.22±0.10

圖1 CASC2在神經膠質瘤組織中及A127、U251、U87細胞系中的表達水平Fig.1 Expression level of CASC2 in glioma tissues and A127，U251，U87 cell linesNote: *.P<0.05 vs HA group.

圖2 CASC2與miR-634在U87細胞系中的調控關系Fig.2 Regulation of CASC2 and miR-634 in U87 cell lineNote: *.P<0.05 vs HA group;#.P<0.05 vs CASC2-NC mimics group.

圖3 過表達CASC2可抑制U87細胞系增殖、遷移和侵襲的影響Fig.3 Overexpression of CASC2 can inhibit the prolifera-tion,migration and invasion of U87 cell lineNote: *.P<0.05 vs CASC2-NC mimics.

2.4 過表達CASC2可抑制U87細胞系增殖、遷移和侵襲 CCK-8實驗結果表明過表達CASC2后，在24、48、72 h時間點，U87細胞增殖數量較對照組明顯減少[(0.20±0.06)vs(0.26±0.08)、(0.31±0.10)vs(0.47±0.19)、(0.53±0.21)vs(0.82±0.28)，(P<0.05，圖3A)]；過表達CASC2表達后，Transwell實驗表明U87細胞遷移及侵襲數量明顯低于對照組[(228.79±29.65)vs(358.13±47.02)、(158.77±22.51)vs(262.33±31.40)，P<0.05，圖3B]。

2.5 過表達miR-634可促進U87細胞系增殖、遷移和侵襲的影響 CCK-8實驗結果表明過表達miR-634后，在24、48、72 h時間點，U87細胞增殖數量較對照組明顯增加[(0.23±0.05)vs(0.18±0.03)、(0.43±0.08)vs(0.32±0.06)、(0.75±0.08)vs(0.44±0.09)，(P<0.05，圖4A)]，Transwell實驗表明U87細胞遷移及侵襲數目明顯多于對照組[(258.47±30.69)vs(162.13±21.58)、(222.82±27.10)vs(164.25±23.79)，P<0.05，圖4B]。

2.6 過表達miR-634負向調控EGFR、PI3K、p-AKT蛋白的表達 實驗結果表明過表達miR-634后，與對照組相比，EGFR、PI3K、p-AKT蛋白表達均不同程度降低，與miR-634的表達呈明顯負相關(P<0.05，圖5)。

圖4 過表達miR-634可促進U87細胞系增殖、遷移和侵襲Fig.4 Overexpression of miR-634 can enhance the proliferation,migration and invasion of U87 cell line

圖5 過表達miR-634對EGFR、PI3K和p-AKT蛋白表達影響Fig.5 Effect of miR-634 overexpression on EGFR,PI3K and p-AKT protein expression

3 討論

由于腫瘤呈浸潤性生長，因而神經膠質瘤復發率高，預后極差[7]，目前放療及化療等輔助治療手段對神經膠質瘤的治療起到一定的作用，但是效果并不顯著，5年生存率尚不足5%,平均生存期僅14個月[8]，因此迫切需要尋找治療神經膠質瘤的新方法。研究發現除蛋白質編碼基因發生突變或異常表達外，非編碼RNA，尤其是LncRNA的突變和調節在癌癥中起主要作用[9]。正常情況下LncRNA可能表現出腫瘤抑制和促癌功能，其表達異常可直接影響腫瘤細胞的惡性生物學行為，并且LncRNA與腫瘤細胞耐藥性、腫瘤診斷及預后具有顯著相關性[10]。Nie等[11]研究表明LncRNA-UCA1可以通過作用于下游微小RNA(miR-193a-3p)，上調ERBB4蛋白的表達，影響非小細胞肺癌的增殖和轉移，沉默LncRNA-UCA1表達后，非小細胞肺癌的增殖和轉移能力明顯增加，同時多種LncRNAs包括CRNDE、MEG3和HOTAIR，已經被鑒定為神經膠質瘤發生發展中的新調節劑，可作為潛在的治療靶標[12]。因此LncRNA在腫瘤發病機制中的作用是確切的，但其是否具有特異性及敏感性，與在體神經膠質瘤的診斷及預后關系仍不能明了。

CASC2 最初在子宮內膜癌患者中被發現為潛在的腫瘤抑制因子，已被證明具有調節胃癌細胞增殖的能力并與胃癌患者的預后相關[13]。 Gan等[14]對80例原發性肝癌患者的組織進行分析發現，62%的患者組織中CASC2出現了明顯下降，并通過過表達CASC2，發現原發性肝癌細胞在小鼠體內成瘤能力明顯增加，因此CASC2可能是惡性腫瘤發生發展的共同關鍵因子，然而，CASC2在神經膠質瘤中的作用仍不清楚。因此本研究通過實時定量PCR檢測，發現CASC2在神經膠質瘤組織及細胞中表達明顯降低，進一步增強CASC2的表達后，細胞的增殖、侵襲和轉移受到明顯抑制，這與CASC2在乳腺癌、結腸癌和胃癌中的表達趨勢一致。同時我們收集整理18例神經膠質瘤患者相關臨床資料進行對比分析，結果發現神經膠質瘤病理分期越低，CASC2在神經膠質瘤組織中表達水平越高，并且在發生轉移的患者中CASC2的表達水平明顯降低，可見CASC2在神經膠質瘤的發生發展過程中扮演者抑癌基因的角色，可作為治療時增強療效的潛在靶標。

miRNA是由長度為20～22個核苷酸組成的短鏈非編碼RNA，miRNA通過轉錄后水平與3′-UTR結合來調節靶基因的表達[15,16]。越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤的發生發展過程中扮演著重要角色，通過與靶基因的3′-UTR結合，形成RNA誘導或沉默復合體，在轉錄或翻譯水平對靶基因表達進行上調或下調，從而對腫瘤細胞生物學行為產生影響[17]。例如miR-634可增強神經膠質瘤CNE-1/Taxol細胞對化療藥物的敏感性，加速神經膠質瘤細胞DNA的損傷[18]。miR-634通過下調mTOR基因的表達，促進宮頸癌細胞凋亡，抑制其惡性生物學行為，并且與宮頸癌的分級分期存在密切的關系[19]。然而神經膠質瘤中CASC2是否與miR-634有相互作用尚不清楚。因此我們進一步對CASC2與miR-634的相互作用機制進一步探究，我們發現miR-634的表達水平在神經膠質瘤組織及細胞中明顯降低，進一步增強miR-634的表達后，細胞的增殖、侵襲、轉移明顯增強，這也驗證miR-634在神經膠質瘤進展過程中起著促癌基因的作用，同時我們使用TargetScan、Starbase數據庫預測CASC2的靶基因，發現CASC2與miR-634具有互補結合序列，推測miR-634為CASC2的下游靶基因，熒光光素酶基因報告顯示CASC2 mimics與野生型載體miR-634 3′UTR Wt共轉染后，miR-634的熒光素酶活性顯著降低，表明miR-634是CASC2的靶基因，靶向調控miR-634表達水平，可抑制神經膠質瘤胞的增殖、侵襲及轉移。EGF于1962年在新生鼠中被首次發現[20]。約20年后EGFR被分離純化[21]。EGFR主要是通過二聚化后刺激Ras蛋白,導致磷酸化級聯反應而激活PI3K/Akt信號通路,從而引起腫瘤的發生、發展[22]。研究表明EGFR和PI3K的表達水平隨神經膠質瘤級別上升而增高，EGFR的表達與PI3K的表達呈正相關,可以表明EGFR過表達可能通過激活PI3K信號通路在膠質瘤的發生發展中起作用[23]。并且本實驗結果表明促進miR-634表達后，EGFR、PI3K、P-AKT蛋白表達均不同程度降低，與miR-634的表達呈明顯負相關，這也表明CASC2可通過下調miR-634的表達抑制神經膠質瘤細胞的增殖、侵襲、轉移，其有效作用機制可能是通過抑制EGFR/PI3K/AKT通路實現。但遺憾的是本研究并沒有直徑證據證明CASC2是調控EGFR/PI3K/AKT直接證據，也未進行相關臨床研究，后續還將進一步探討。

綜上所述，本研究證明CASC2可靶向調控miR-634基因的表達，通過EGFR/PI3K/AKT通路，從而抑制神經膠質瘤細胞的增殖、侵襲及轉移，可為神經膠質瘤的靶向治療及臨床藥物的研制提供新的思路。