合成環(huán)瓜氨酸蛋白短肽誘導(dǎo)獼猴類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型的研究①

蔡 理 余焙佳 畢亞男 曹艷艷 陳 永 郭小文 肖長(zhǎng)虹 陳恩生

(南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣州510315)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以全身多關(guān)節(jié)對(duì)稱性腫痛為特點(diǎn)的慢性炎癥性自身免疫病，其重要病理特征慢性滑膜炎、滑膜血管翳的形成常引起受累關(guān)節(jié)出現(xiàn)進(jìn)行性破壞，導(dǎo)致較高的致殘率[1]。近年大量基礎(chǔ)與臨床研究揭示瓜氨酸化蛋白及抗瓜氨酸化蛋白抗體(Anti-citrullinated protein antibody，ACPAs)在RA免疫炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)和維持過(guò)程中發(fā)揮重要作用，瓜氨酸化蛋白能充當(dāng)誘導(dǎo)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答的始動(dòng)抗原，產(chǎn)生ACPAs并介導(dǎo)軟骨侵蝕及骨質(zhì)破壞，在RA的診斷及病情預(yù)測(cè)上均具有重要意義。目前國(guó)內(nèi)外已建立幾個(gè)以瓜氨酸化蛋白為抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型[2-5]，但由于瓜氨酸化蛋白種類、誘導(dǎo)方式、注射劑量及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳背景不同，各模型表現(xiàn)出不同的關(guān)節(jié)炎特點(diǎn)，且與人類RA也存在諸多差異，制約了這些模型的廣泛應(yīng)用。

本課題組前期研究證明，通過(guò)偶聯(lián)血藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)的人工合成的環(huán)瓜氨酸化波形蛋白短肽(Cyclic citrullinated vimen-tin，CCit-Vim)具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠誘導(dǎo)小鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎，并在其血清中能檢測(cè)到人類RA特異性的ACPAs的存在[6]。但由于RA嚙齒類動(dòng)物模型與人類RA的遺傳背景、免疫學(xué)、病理學(xué)特征上存在較大差異，且關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)太小，不利于多種影像檢查手段的實(shí)施，導(dǎo)致該短肽誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型目前尚不能作為研究人類RA的成熟實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。因此，我們擬以偶聯(lián)血藍(lán)蛋白的環(huán)瓜氨酸化波形蛋白短肽(CCit-Vim+KLH)免疫獼猴，進(jìn)一步來(lái)探討該短肽在靈長(zhǎng)類大動(dòng)物中的免疫原性及誘發(fā)關(guān)節(jié)炎模型的可行性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8只成年雄性獼猴，年齡8～12歲，體重6～10 kg，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXX(粵)2017-0030]。單籠飼養(yǎng)于東莞南方醫(yī)科大學(xué)明珠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，控制實(shí)驗(yàn)室條件為：保持實(shí)驗(yàn)室12 h光照、12 h黑暗交替循環(huán)；室內(nèi)溫度控制在(22±1)℃；相對(duì)濕度控制在50%±20%；室內(nèi)空氣不循環(huán)，但交換12～15次/h。每日用市售的專用猴飼料喂養(yǎng)獼猴，并補(bǔ)充新鮮水果。在此條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。

1.1.2 主要試劑 Zoletil 50麻醉劑(Virbac，法國(guó))，雞Ⅱ型膠原蛋白(Type Ⅱ Collange，CⅡ，成都瑞芬思生物科技有限公司)，完全/不完全弗氏佐劑(Sigma，美國(guó))，抗CⅡ抗體、抗CCP(Cyclic citrullina-ted peptide，CCP)抗體、TNF-α、IL-6等ELISA檢測(cè)試劑盒(上海紀(jì)寧生物科技有限公司)，HE染液(Panera)。

1.2 方法

1.2.1 環(huán)瓜氨酸化蛋白短肽及偶聯(lián)肽的合成 參考文獻(xiàn)[7]研究成果，選定CCit-Vim 26～44位氨基酸序列：SSXSYVTTSTXTYSLGSAL，參考文獻(xiàn)的[8]方法，將此短肽中1、14位的2個(gè)精氨酸替換為半胱氨酸，形成二硫鍵，合成環(huán)狀短肽(CCit-Vim 26～44)，再與KLH偶聯(lián)形成偶聯(lián)物(CCit-Vim 26～44-KLH)，純度為98%。該部分內(nèi)容委托武漢ABclonal生物公司人工合成。

1.2.2 模型制作

1.2.2.1 抗原乳化液制備 將10 mg雞CⅡ，加入0.1 mol/L乙酸溶液1 ml，4℃攪拌過(guò)夜，配制成10 mg/ml的CⅡ溶液[9,10]；4 mg CCit-Vim+KLH粉末，溶于2 ml 1×PBS中，配成2 mg/ml的CCit-Vim+KLH溶液。在超凈臺(tái)中，使用精密勻漿器分別將10 mg/ml的CⅡ溶液1 ml、2 mg/ml的CCit-Vim+KLH溶液2 ml與等體積的完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑混勻乳化，終濃度分別為5 mg/ml、1 mg/ml[2]。乳化條件為冰浴上操作，勻漿器25 000 r/min，2 min，暫停2 min，反復(fù)4次，至形成油包水白色乳液，滴至水中不擴(kuò)散為好。

1.2.2.2 獼猴分組 8只獼猴隨機(jī)分為2組，每組4只，分別為CCit-Vim+KLH組(CCV+K-IA)、CⅡ組(CIA)。各組年齡、體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2.2.3 造模 CCV+K-IA組注射CCit-Vim+KLH乳化液，首次誘導(dǎo)免疫選擇在獼猴背部，分為10個(gè)部位皮下注射，總劑量為2 mg(1 mg/ml)。首次免疫后第4周和第8周分別進(jìn)行強(qiáng)化免疫一次，劑量及注射方式同前；CIA組注射CⅡ乳化液，首次誘導(dǎo)免疫選擇在獼猴背部，分為10個(gè)部位皮下注射，總劑量為5 mg(5 mg/ml)。首次免疫后4周進(jìn)行強(qiáng)化免疫一次，劑量及注射方式同前[9,11]。

1.2.3 模型評(píng)價(jià)

1.2.3.1 獼猴一般狀況及關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)的觀察 ①注射前及注射后每周稱重記錄體重變化及觀察有無(wú)脫毛等情況。②免疫前后每周采用獸用紅外線體表溫度計(jì)測(cè)量食蟹猴關(guān)節(jié)溫度變化。③受累關(guān)節(jié)活動(dòng)功能情況：每天觀察受累關(guān)節(jié)的活動(dòng)情況，注意是否出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、畸形及活動(dòng)狀況。

1.2.3.2 炎癥指標(biāo)及血清學(xué)檢測(cè) 首次免疫后第4、8、12周，獼猴麻醉后采集外周血，全血采用魏氏法檢測(cè)紅細(xì)胞沉降率 (Erythrocyte sedimentation rate，ESR)；其余外周血3 000 r/min離心10 min后獲取血清置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩反應(yīng)蛋白(C-reaction protein，CRP)、抗CⅡ抗體、抗CCP抗體、TNF-α、IL-6水平：根據(jù)相關(guān)抗體的ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。ELISA法檢測(cè)CCit-Vim短肽抗體:pH7.4的1×PBS溶解 CCit-Vim短肽(等電點(diǎn)5.51) 至終濃度 20 μg/ml，先用100 μl短肽抗原包被 96孔酶標(biāo)板，采用HRP標(biāo)記的羊抗鼠通用型二抗，TMB顯色，酶標(biāo)儀讀取450 nm的OD值。

1.2.3.3 影像學(xué)檢查 免疫后第4周與第8周分別進(jìn)行四肢關(guān)節(jié)的影像學(xué)檢查(雙手關(guān)節(jié)X線、四肢關(guān)節(jié)超聲)。X線雙手關(guān)節(jié)Sharp評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[12]：骨侵蝕評(píng)分：①關(guān)節(jié)面骨質(zhì)疏松、中斷，計(jì)1分；②關(guān)節(jié)侵蝕但不超過(guò)骨關(guān)節(jié)面的1/2，計(jì)2分；③關(guān)節(jié)侵蝕約占骨關(guān)節(jié)面的1/2,計(jì)3分；④關(guān)節(jié)侵蝕超過(guò)1/2，但尚有部分正常關(guān)節(jié)面,計(jì)4分；⑤關(guān)節(jié)面骨質(zhì)完全破壞，計(jì)5分。關(guān)節(jié)間隙狹窄評(píng)分：①局部狹窄或可疑關(guān)節(jié)間隙狹窄，計(jì)1分；②普遍狹窄,但程度不超過(guò)正常的1/2，計(jì)2分；③狹窄程度等于或超過(guò)正常的1/2，計(jì)3分；④關(guān)節(jié)間隙消失、強(qiáng)直，計(jì)4分。關(guān)節(jié)超聲標(biāo)準(zhǔn)(EULAR-OMERACT關(guān)于RA滑膜炎超聲分級(jí)的組合評(píng)分系統(tǒng))[13]：0級(jí)：正常關(guān)節(jié)，即灰階超聲未見(jiàn)滑膜增厚(Synovial hypertrophy，SH)(低回聲)，無(wú)論是否存在積液(Effusion)(無(wú)回聲)，滑膜內(nèi)未見(jiàn)血流信號(hào)(Power doppler，PD)；1級(jí)：輕度滑膜炎，即1級(jí)滑膜增厚+≤1級(jí)血流信號(hào)；2級(jí)：中度滑膜炎，即2級(jí)滑膜增厚+≤2級(jí)血流信號(hào)或者1級(jí)滑膜增厚+2級(jí)血流信號(hào)；3級(jí)：嚴(yán)重滑膜炎，即3級(jí)滑膜增厚+≤3級(jí)血流信號(hào)或者1級(jí)/2級(jí)滑膜增厚+3級(jí)血流信號(hào)。

1.2.3.4 組織病理學(xué)檢測(cè) 首次免疫后12周采用安樂(lè)死處死8只獼猴，獲取足掌指間關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)、雙膝關(guān)節(jié)，10%福爾馬林溶液浸泡固定后放入10%硝酸脫鈣液中脫鈣24 h，隨后脫水進(jìn)行石蠟包埋,切成5 μm 切片。HE染色、中性樹(shù)膠封片,光鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜厚度、軟骨及骨侵蝕情況。半定量評(píng)分法評(píng)價(jià)滑膜增生程度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下[14]：滑膜增生程度分為0～4分；0分：無(wú)滑膜增生；1分：滑膜增生，滑膜成纖維細(xì)胞密度低，未能侵犯到皮下組織；2分：滑膜成纖維細(xì)胞密度較高，并侵犯到皮下組織；3分：在2分的基礎(chǔ)，滑膜組織內(nèi)或侵犯區(qū)出現(xiàn)纖維化壞死結(jié)節(jié)；4分：除有3分的表現(xiàn)外，還見(jiàn)到至少一個(gè)以上類似生發(fā)中心的滑膜細(xì)胞簇集區(qū)。

2 結(jié)果

2.1 兩組獼猴的臨床表現(xiàn) 如圖1所示，兩組獼猴中共有7只出現(xiàn)關(guān)節(jié)癥狀，其中CCV+K-IA組中發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)癥狀的3只獼猴于首次免疫后第4周開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)雙手指間關(guān)節(jié)僵硬無(wú)法屈伸，至第6周部分表現(xiàn)為臨床常見(jiàn)的“天鵝頸樣”畸形，行為活動(dòng)受限，并持續(xù)至觀察期結(jié)束；CIA組4只獼猴于第4周出現(xiàn)類似關(guān)節(jié)炎癥狀，其關(guān)節(jié)炎癥狀表現(xiàn)、發(fā)生部位與CCV+K-IA組相似；兩組獼猴于首次免疫后均出現(xiàn)不同程度的食量下降，情緒冷漠且行動(dòng)遲緩，體重由首次免疫后均平緩下降，并在第4周左右進(jìn)入穩(wěn)定期，平均體重較注射前減輕5%～10%，并在首次免疫后第2周開(kāi)始可觸及四肢、足掌溫度高于軀干，平均增長(zhǎng)1.0～1.5℃，并持續(xù)至觀察期結(jié)束。

2.2 炎癥指標(biāo) 兩組獼猴不同程度的ESR、CRP升高，提示兩組獼猴在首次免疫后均處于炎癥活動(dòng)期。如圖2所示，其中兩組獼猴的CRP水平在首次免疫后均高于正常水平(CRP>1 mg/L)并持續(xù)至觀察期結(jié)束，而CIA組中發(fā)展成急性關(guān)節(jié)炎癥狀的1只獼猴，CRP水平在首次免疫后1～2周時(shí)處于高峰期(CRP>50 mg/L)；在首次免疫后，僅有CIA組中發(fā)生急性關(guān)節(jié)炎癥狀的1只獼猴出現(xiàn)ESR水平明顯升高(ESR>20 mm/h)，而在加強(qiáng)免疫后第1周，CCV+K-IA組3只獼猴與CIA組4只獼猴的ESR高于正常水平，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，但在第12周觀察期結(jié)束時(shí)所有獼猴的ESR水平均在正常值范圍。

圖1 兩組獼猴的關(guān)節(jié)癥狀表現(xiàn)Fig.1 Joint symptoms of two groups of macaquesNote: A1，A2，A3，A4.CIA；B1，B2，B3.CCV+K-IA.

圖2 免疫后獼猴的ESR和CRP水平Fig.2 Levels of ESR and CRP in rhesus monkeys afterimmunization

2.3 抗體水平 兩組獼猴均產(chǎn)生不同水平的抗CCit-Vim、抗CⅡ抗體、抗CCP抗體，這提示經(jīng)CCit-Vim+KLH短肽誘導(dǎo)，即使無(wú)臨床表現(xiàn)的獼猴，也存在對(duì)短肽產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)。我們檢測(cè)了2種瓜氨酸化表位特異性抗體水平(如圖3所示)，一是抗CCit-Vim短肽抗體：免疫前CCV+K-IA與CIA組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，免疫后第12周CCV+K-IA高于CIA組，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；二是抗CCP抗體：免疫前與免疫后第12周CCV+K-IA與CIA組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？笴Ⅱ抗體水平：CCV+K-IA與CIA組每4周表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 炎癥因子 如圖4所示，TNF-α：CCV+K-IA與CIA組每4周表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖3 血清抗體水平Fig.3 Levels of serum antibodyNote: *.P<0.05.

圖4 血清炎癥因子水平 Fig.4 Inflammatory factorNote: *.P<0.05.

(P>0.05)。IL-6：免疫后第4、8周兩組表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第12周CCV+K-IA組IL-6表達(dá)水平高于CIA組(P<0.05)。

2.5 雙手X線 對(duì)比免疫后第4周和第8周X光影像檢查結(jié)果可見(jiàn)，兩組獼猴關(guān)節(jié)病變呈進(jìn)行性發(fā)展，如圖5A1、A2顯示：兩組獼猴的雙手指間關(guān)節(jié)均可觀察到不同程度的關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹、關(guān)節(jié)間隙顯示模糊、狹窄，部分可見(jiàn)間隙融合；部分獼猴還可觀察到近端指間關(guān)節(jié)端骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)表面骨質(zhì)破壞，腕關(guān)節(jié)皮質(zhì)下小囊狀性變及遠(yuǎn)端指間關(guān)節(jié)嚴(yán)重畸形等。如圖6所示，與免疫后第4周相比，CIA與CCV+K-IA組的X線sharp評(píng)分在第8周較第4周均有升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而同期評(píng)分兩組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 關(guān)節(jié)超聲 如圖7B1、B2顯示：兩組獼猴的雙手指間關(guān)節(jié)、雙足跖趾關(guān)節(jié)及腕關(guān)節(jié)均可見(jiàn)不同程度的滑膜炎以及血流信號(hào)，提示炎癥反應(yīng)存在，部分

圖5 免疫后第4周和第8周X線檢查Fig.5 X-ray at 4 and 8 weeks after immunizationNote: A1.CIA；A2.CCV+K-IA.

圖6 X-ray sharp評(píng)分Fig.6 X-ray sharp scoreNote: *.P<0.05.

圖7 免疫后第4周和第8周關(guān)節(jié)超聲改變Fig.7 Ultrasound classification changes at 4 and 8 weeks after immunizationNote: B1.CIA；B2.CCV+K-IA.

圖8 超聲滑膜炎評(píng)分Fig.8 Ultrasonic synovitis scoreNote: *.P<0.05.

獼猴可探查到指間關(guān)節(jié)骨質(zhì)增生，手腕關(guān)節(jié)滑膜炎、肌腱炎等；如圖8所示，與免疫后第4周相比，CIA與CCV+K-IA組的超聲滑膜炎分級(jí)評(píng)分在第8周較第4周均有升高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而同期評(píng)分兩組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.7 關(guān)節(jié)組織病理學(xué) 根據(jù)影像學(xué)檢查結(jié)果指示，分別獲取兩組獼猴的腕、膝關(guān)節(jié)滑膜組織及近端指間關(guān)節(jié)組織。其中腕關(guān)節(jié)滑膜HE染色(圖9A1、B1)與膝關(guān)節(jié)滑膜HE染色(圖9A2、B2)顯示：兩組獼猴腕、膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)腔中取得的滑膜組織中均可見(jiàn)到大量滑膜細(xì)胞，并伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜血管翳形成，且膝關(guān)節(jié)部位滑膜成纖維細(xì)胞密度較癥腕關(guān)節(jié)更高，滑膜細(xì)胞在10～12層間；近端指間關(guān)節(jié)HE染色(圖9A3、B3)顯示：兩組獼猴近端指間關(guān)節(jié)均可見(jiàn)輕中度的滑膜增生向關(guān)節(jié)腔內(nèi)生長(zhǎng)，滑膜細(xì)胞在3～5層間，部分可見(jiàn)侵犯軟骨表面，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。如圖10所示，對(duì)兩組各關(guān)節(jié)部位滑膜增生程度進(jìn)行半定量評(píng)分，CCV+K-IA與CIA組的指間、腕、膝關(guān)節(jié)滑膜增生半定量評(píng)分相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖9 獼猴腕、膝關(guān)節(jié)滑膜及近端指間關(guān)節(jié)病理學(xué)HE染色(×10)Fig.9 HE staining of wrist,knee and proximal interphal-angeal joints(PIP) synovium in monkeys(×10)Note: A1,A2,A3.CIA;B1,B2,B3.CCV+K-IA.

圖10 滑膜增生評(píng)分Fig.10 Score of synovial hyperplasia

3 討論

我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，以人工合成偶聯(lián)KLH的CCit-Vim短肽作為抗原誘導(dǎo)劑具有較強(qiáng)的免疫原性，能誘導(dǎo)DBA1/J小鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎[6]。但由于該環(huán)瓜氨酸化蛋白短肽誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型在關(guān)節(jié)炎發(fā)病特點(diǎn)、免疫學(xué)、病理學(xué)特征方面與CIA以及人類RA尚存在諸多差異，導(dǎo)致該小鼠模型目前尚不能成為一個(gè)理想的RA動(dòng)物模型。為進(jìn)一步揭示該合成短肽的致關(guān)節(jié)炎作用，建立更加符合人類RA病情特點(diǎn)的RA模型，我們選擇與人類親緣關(guān)系更接近、且更加適合采用現(xiàn)代影像學(xué)檢查手段的靈長(zhǎng)類大動(dòng)物獼猴作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行造模。本次研究發(fā)現(xiàn)，偶聯(lián)KLH的CCit-Vim短肽不僅能誘導(dǎo)小鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎，也能誘導(dǎo)非人靈長(zhǎng)類獼猴產(chǎn)生更接近人類RA病情發(fā)展的關(guān)節(jié)炎癥狀。首次免疫后CCV+K-IA組獼猴體重出現(xiàn)減輕、行動(dòng)遲緩，第4周可觸及雙手指間部分關(guān)節(jié)僵硬無(wú)法屈伸，持續(xù)加重直至第6周開(kāi)始出現(xiàn)畸形，且受累關(guān)節(jié)數(shù)逐漸增多，并由手關(guān)節(jié)逐漸發(fā)展至足關(guān)節(jié)。相較于RA鼠、兔等動(dòng)物模型，CCV+K-IA誘導(dǎo)獼猴發(fā)生的關(guān)節(jié)炎癥狀、部位與人類RA更加接近，且始終高于正常水平的CRP也提示關(guān)節(jié)持續(xù)處于炎癥的活動(dòng)期，造成關(guān)節(jié)炎發(fā)病的持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。但CCV+K-IA獼猴早期并沒(méi)有出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫、發(fā)熱痛的急性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，而突出表現(xiàn)為緩慢發(fā)展的關(guān)節(jié)變形，直至實(shí)驗(yàn)觀察后期出現(xiàn)典型關(guān)節(jié)畸形的功能障礙，這一點(diǎn)與臨床上一部分RA患者關(guān)節(jié)腫痛不明顯、而疾病后期關(guān)節(jié)變形顯著是相符合的。

現(xiàn)代RA的臨床治療中，影像監(jiān)測(cè)成為RA病情活動(dòng)判斷的重要指標(biāo)。其中關(guān)節(jié)X線的使用最為廣泛，對(duì)評(píng)估關(guān)節(jié)的骨質(zhì)破壞具有重要的意義，但對(duì)早期病變?nèi)缁ぴ錾?、軟骨侵蝕缺乏敏感性，而關(guān)節(jié)超聲則對(duì)滑膜、軟骨、關(guān)節(jié)積液、肌腱等早期病變能清楚分辨[15]，并可以清楚顯示滑膜內(nèi)的血流信號(hào)[16]。CCV+K-IA組的X線平片上能觀察到雙手指間關(guān)節(jié)間隙狹窄，部分可見(jiàn)關(guān)節(jié)軟組織腫脹、關(guān)節(jié)端骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)表面骨質(zhì)破壞。關(guān)節(jié)超聲則顯示雙手指間關(guān)節(jié)、雙足跖趾關(guān)節(jié)及腕關(guān)節(jié)可探查到滑膜炎和肌腱炎的存在。雙手X線和關(guān)節(jié)超聲兩次檢查結(jié)果對(duì)比顯示，CCV+K-IA獼猴較前次檢查時(shí)受累關(guān)節(jié)數(shù)有所增加且關(guān)節(jié)滑膜炎病變程度加重，其中手關(guān)節(jié)破壞先于足關(guān)節(jié)，這些特征都與臨床RA非常相似。雙手X線和關(guān)節(jié)超聲定量評(píng)分結(jié)果均顯示，CCV+K-IA組與CIA組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們選取觀察到影像學(xué)改變的關(guān)節(jié)部位組織進(jìn)行切片染色，其病理實(shí)質(zhì)可見(jiàn)大量滑膜細(xì)胞和明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以及不同程度的滑膜增生和骨質(zhì)破壞，提示CCV+K-IA獼猴即使到了關(guān)節(jié)變形的后期改變時(shí)其病變關(guān)節(jié)仍處于關(guān)節(jié)滑膜炎的活動(dòng)期，這與臨床觀察到持續(xù)加重的關(guān)節(jié)畸形也相符合，更好地模擬了人類RA呈慢性滑膜炎癥及進(jìn)展性骨質(zhì)破壞的特點(diǎn)。

兩組獼猴產(chǎn)生了不同水平的抗CCit-Vim短肽抗體、抗CCP抗體，說(shuō)明CCit-Vim短肽作為抗原誘導(dǎo)劑引起了獼猴免疫系統(tǒng)的應(yīng)答反應(yīng)。CCV+K-IA組獼猴產(chǎn)生抗CCit-Vim短肽抗體的水平顯著高于CIA組，這說(shuō)明偶聯(lián)KLH的CCit-Vim短肽能夠誘導(dǎo)獼猴產(chǎn)生免疫應(yīng)答并產(chǎn)生特異性的抗CCit-Vim抗體，提示CCit-Vim+KLH偶聯(lián)肽具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠引起強(qiáng)免疫系統(tǒng)針對(duì)短肽中瓜氨酸抗原表位的應(yīng)答能力，產(chǎn)生大量的ACPAs以產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎。針對(duì)血清中的抗CCP抗體，CCV+K-IA組與CIA組產(chǎn)生了相似的抗體水平，一方面提示CⅡ可能含有CCP的抗原決定簇，兩者存在較多的同源性，能夠誘導(dǎo)獼猴產(chǎn)生抗CCP抗體；另一方面，在我們前期小鼠關(guān)節(jié)炎模型的研究中，CIA組反而較CCV+K-IA組產(chǎn)生了更高的抗CCP抗體水平，提示了動(dòng)物種屬遺傳背景對(duì)造模成功的重要性。CCV+K-IA組與CIA組第4、8周的血清TNF-α、IL-6水平比較兩組間差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但第12周CCV+K-IA組產(chǎn)生了較CIA組更高的血清IL-6水平，說(shuō)明CCV+K-IA組比CIA組處于一個(gè)時(shí)間更長(zhǎng)的炎癥反應(yīng)過(guò)程，提示我們延長(zhǎng)造模周期可能使CCV+K-IA組產(chǎn)生更多ACPAs，從而導(dǎo)致更嚴(yán)重的骨損傷。TNF-α、IL-6是RA重要的炎癥因子，抗TNF-α和抗IL-6單抗治療RA已在臨床得到廣泛證實(shí)。CCV+K-IA有可能作為針對(duì)IL-6靶點(diǎn)的藥物治療模型。

綜上所述，本研究首次在非人靈長(zhǎng)類大動(dòng)物獼猴上，以人工合成的CCit-Vim作為抗原誘導(dǎo)劑研制環(huán)瓜氨酸化蛋白短肽誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型。盡管該模型關(guān)節(jié)炎發(fā)病率未能達(dá)到100%，但其慢性進(jìn)行性骨質(zhì)破壞、關(guān)節(jié)變形等關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，以及免疫學(xué)、影像學(xué)、病理學(xué)特征與人類RA已非常相似。與既往的幾種瓜氨酸化蛋白誘導(dǎo)性鼠模型相比，該模型能更好地模擬人類RA產(chǎn)生癥狀的關(guān)節(jié)部位，且慢性持續(xù)性的關(guān)節(jié)滑膜炎和持續(xù)進(jìn)展的骨質(zhì)破壞也體現(xiàn)了人類RA慢性侵蝕性的病理特點(diǎn)，可在RA的發(fā)病機(jī)制、病理研究、新藥研發(fā)和藥理藥效學(xué)研究等方面發(fā)揮重要平臺(tái)作用。