系統性硬化癥患者外周血中miR-155的表達與Th17細胞的關系

周 燕 張媛媛

(重慶市第四人民醫院檢驗科，重慶400014)

系統性硬化癥(Systemic sclerosis)是一種慢性自身免疫疾病，目前臨床主要以控制患者癥狀、延緩對靶器官的損傷等治療為主，以往研究主要從遺傳與環境因素、免疫學異常、血管病變等方面探索其具體的發病機制[1]。Th17細胞是T效應淋巴細胞亞群的T輔助細胞之一，其分泌的細胞因子可在自身免疫及纖維化疾病中發揮重要作用[2]。miR-155是一種多功能性miRNA，可通過下調靶基因CTLA-4表達進而參與造血、免疫等多種病理生理過程，同時可在多種惡性腫瘤、類風濕等疾病中發揮重要作用[3]。miR-155在系統性硬化癥中尚未見研究報道，因此本研究探討了系統性硬化癥患者外周血中miR-155表達及其與Th17細胞的關系，旨在為臨床治療提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 選取2015年6月至2017年3月于我院風濕免疫科住院及門診治療的系統性硬化癥患者58例為研究組，另選取本院同期健康體檢者61例作為對照組。研究組中男10例，女48例，年齡21～60歲，平均(40.35±6.78)歲，病程為2～24月，平均(13.12±10.02)個月。對照組中男11例，女50例，年齡21～61歲，平均(41.28±9.47)歲。兩組臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準:①系統性硬化癥患者符合相關診斷標準[4]；②病程≤2年；③臨床資料完整；④未經治療或治療后停藥3個月以上者；⑤患者知情且簽署同意書。排除標準:①皮膚嚴重萎縮、硬化且處于晚期患者；②合并心、肺、腎等嚴重疾病；③妊娠或哺乳期患者；④精神病患者；⑤合并有心腦血管、肝腎等原發性疾病；⑥假性硬皮病或外傷引起者。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，反轉錄試劑盒(Fermentas公司)，qRT-PCR試劑盒(美國Invitmgen公司)，ELISA試劑盒(中國深圳晶美生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 兩組受試人員于次日清晨抽取空腹靜脈血10 ml，肝素鈉抗凝，其中一部分分離外周血單核細胞用于檢測miR-155表達水平，另一部分用于檢測血漿IL-17、IL-21水平、Th17細胞及胞內CTLA-4的表達水平。

1.2.2 qRT-PCR法檢測兩組外周血單核細胞中miR-155表達水平 在1.5 ml離心管中加入1 ml紅細胞裂解液并取抗凝血0.5 ml混勻，置于室溫10 min，5 000 r/min離心5 min后收集底部的細胞，并重復一遍，按照Trizol試劑盒操作步驟提取總RNA。采用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，并進行qRT-PCR反應、檢測miR-155的相對表達量，反應體系為20 μl:10 μl 2×SYBR Mix，10×cDNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，H2O 8 μl，反應程序設定為95℃ 5 min(預變性)，95℃ 30 s(變性)、60℃ 30 s(退火)，72℃ 1 min(延伸)，共30個循環，72℃ 10 min(終延伸)。每個樣本設置3個平行反應復孔。在PCR儀上進行反應，其中引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。反應結束后對數據進行分析，miR-155以U6作為內參按照2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.2.3 檢測血漿IL-17、IL-21水平 將兩組人員靜脈血靜置并留取血漿0.5 ml，-20℃冰箱保存，嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明進行操作，將其置于酶標儀上進行檢測并讀取A值，運用ELISA軟件繪制標準曲線并計算血清IL-17、IL-21的濃度。

1.2.4 流式細胞儀檢測外周血Th17細胞及CTLA-4表達比例 收集留存血漿后剩余的血細胞并加入磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，分離單個核細胞，濃度調整為1×106細胞/ml，將其滴入24孔細胞培養板內，每孔1.5×106細胞/ml，分別在37℃恒溫、5%CO2條件下培養5 h。采用2支試管收集細胞，1 000 r/min離心5 min后棄上清液并加入100 μl PBS重懸細胞，每管分別加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗人CD4單抗，室溫下孵育30 min。用PBS洗滌細胞，1 000 r/min 離心5 min后棄上清，加入500 μl固定液混合均勻并放置30 min，離心后棄上清并加入500 μl破膜劑混合均勻，重復一次。將別藻藍蛋白(APC)標記的抗人IL-17單抗2 μl加入其中一支試管，在另一支試管中加入CTLA-4 APC 2 μl，4℃下孵育30 min。孵育后再次清洗并離心10 min，棄上清并加入500 μl PBS重懸，立即上機檢測。設標記抗體為同型對照并以CD4+設門，采用美國BD公司FAcsCalibur流式細胞儀檢測CD4+、CTLA-4+、IL-17+陽性細胞及其所占比例，其中IL-17+細胞代表Th17細胞。

2 結果

2.1 兩組外周血miR-155、IL-17、IL-21水平的比較 研究組患者外周血miR-155、IL-17、IL-21水平均明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

2.2 兩組外周血Th17/CD4+、CTLA-4/CD4+與Th17細胞的比較 研究組外周血Th17細胞及其占CD4+T細胞比例明顯高于對照組，CTLA-4的表達比例明顯低于對照組(P<0.05)。見表3。

2.3 檢測系統性硬化癥患者miR-155、CTLA-4、Th17細胞、IL-17及IL-21相關性 Pearson法顯示外周血miR-155表達水平與Th17細胞、IL-17及IL-21呈正相關，CTLA-4表達與Th17細胞、IL-17及IL-21呈負相關，Th17細胞與IL-17、IL-21呈正相關(P<0.05)。見表4。

2.4 ROC分析研究組患者外周血miR-155表達與Th17細胞的診斷價值 ROC分析顯示miR-155的敏感度為79.73%，特異度為97.62%，截斷值為1.16；Th17細胞的敏感度為72.97%，特異度為92.86%，截斷值為1.16%。見表5、圖1。

2.5 影響系統性硬化癥患者的相關因素分析 將影響系統性硬化癥患者相關因素進行Logistic多元回歸分析，結果顯示患者外周血miR-155表達水平、Th17細胞比例、CTLA-4表達水平、IL-17及IL-21均是影響系統性硬化癥患者的危險因素。見表6。

GroupnmiR-155IL-17(pg/ml)IL-21(pg/ml)Control group610.98±0.1217.29±5.1211.26±1.75Research group582.03±0.2156.27±6.2928.78±3.52t33.69637.15834.637P0.0000.0000.000

GroupnTh17/CD4+Th17 cellCTLA-4/CD4+Control group610.23±0.120.52±0.341.44±0.21Research group581.75±0.681)4.87±1.161)0.47±0.071)

Note：1)P<0.05 compared with the control group.

表4 相關性檢測結果(r/P)

Tab.4 Correlation test results(r/P)

IndexmiR-155CTLA-4Th17IL-17CTLA-4-0.335/0.01---Th170.450/0.000-0.501/0.000--IL-170.417/0.001-0.458/0.0000.698/0.000-IL-210.328/0.012-0.275/0.0370.444/0.0000.271/0.040

表5 研究組患者miR-155與Th17細胞的ROC分析

Tab.5 ROC analysis of miR-155 and Th17 cells in study group

DetectionindicatorAUCStandarderrorZ statistics95%CIPmiR-1550.8580.0379.5850.781-0.916<0.000Th17 cell0.8310.0408.3990.751-0.895<0.000

圖1 系統性硬化癥患者miR-155與Th17細胞的ROC分析Fig.1 ROC analysis of miR-155 and Th17 cells in patients with systemic sclerosis

表6 影響系統性硬化癥患者的相關因素分析

Tab.6 Analysis of related factors affecting patients with systemic sclerosis

Influencing factorβSEWald χ2POR95%CImiR-1550.8160.3744.7600.0122.2611.528-3.347Th171.0680.4276.2510.0032.9082.021-4.185IL-170.5240.3082.8980.0221.6891.305-2.187IL-210.6140.3543.0110.0261.8481.347-2.536CTLA-40.8000.4133.7500.0112.2251.643-3.013

3 討論

系統性硬化癥可影響機體內多個內臟系統的結締組織發生疾病，嚴重降低患者生活質量，明確其發病機制并針對性治療可有效降低患者疾病嚴重程度[5]。研究表明系統性硬化癥的發生常與下游多個免疫細胞的異常相關，IL-6、TNF-α在系統性硬化癥的不同階段時其表達水平存在明顯區別并參與疾病發生發展過程[6,7]。miRNAs可在細胞增殖、分化等過程中發揮重要作用，同時可通過調控靶基因表達對機體內調節性T細胞等其他免疫細胞產生重要影響[8]。

miR-155是由BIC(B細胞非編碼集合基因簇)基因編碼，研究表明miR-155可在銀屑病、系統性紅斑狼瘡等多種免疫相關性疾病中異常表達，可通過調節靶基因CTLA-4的表達參與機體免疫反應過程[9,10]。活化的B細胞、T細胞可促進miR-155表達，CTLA-4是T細胞活化的重要負性調節因子，而miR-155可通過降低靶基因CTLA-4水平進而促使T細胞活化[11]。本研究結果顯示研究組患者外周血miR-155、IL-17、IL-21水平均顯著高于對照組，說明系統性硬化癥患者中miR-155呈高表達。其中IL-17、IL-21可通過增強TNF對成纖維細胞與角質形成細胞的活性進而增加纖維細胞促炎因子數量[12]。推測miR-155表達異常可能促使細胞因子發生紊亂并造成系統性硬化癥患者免疫異常。本研究發現外周血中miR-155相對表達量超過1.42時可能已發生系統性硬化癥，推測miR-155可作為臨床診斷系統性硬化癥的分子標志物。

CD4+T細胞可根據細胞的功能分為Th1、Th2、Th17、Treg四個亞群，病理狀態下促/抗炎因子分泌異常導致Th1與Th2失衡引起機體免疫功能異常，而Th17細胞可分泌IL-17、IL-21等在人類免疫相關性疾病中發揮重要調節作用[13]。本研究結果顯示研究組外周血Th17細胞及其占CD4+T細胞比例顯著高于對照組，IL-17、IL-21水平均顯著升高，說明系統性硬化癥患者體內Th17細胞過度表達并參與疾病的發生過程，且Th17細胞分泌IL-17、IL-21的能力高于正常人，ROC分析結果顯示Th17細胞大于3.11%時極可能發生系統性硬化癥。本研究結果顯示Th17細胞顯著高于對照組，而CTLA-4表達比例顯著低于對照組，相關性分析顯示miR-155表達與Th17細胞呈顯著正相關，而CTLA-4與Th17細胞呈顯著負相關，說明miR-155在系統性硬化癥患者外周血CD4+T細胞中上調表達并可促進CD4+T細胞向Th17型細胞分化。同時Logistic多元回歸分析顯示患者外周血miR-155表達水平、Th17細胞、CTLA-4表達水平、IL-17及IL-21均是影響系統性硬化癥患者的危險因素。

綜上所述，系統性硬化癥外周血中miR-155表達水平顯著升高，Th17細胞比例增加，二者呈顯著正相關并參與疾病發生、發展，檢測系統性硬化癥患者外周血miR-155表達、Th17細胞比例有助于臨床診斷，以miR-155為靶點的治療方案將有助于提高臨床療效。關于miR-155對Th17細胞發揮功能的具體機制有待進一步研究。