lncRNA MAGI2-AS3調控Fas/FasL通路抑制神經母細胞瘤的生長

黃垂名 張小波 彭小旅

(海南省人民醫院小兒外科，海口570100)

神經母細胞瘤是較為常見的神經系統惡性腫瘤，據統計我國每年發病兒童達上千例，且患病兒童常在晚期發現，患兒治療困難，預后差，嚴重影響患者的身心健康[1]。神經母細胞瘤中細胞的異常增殖與細胞侵襲是導致神經母細胞瘤患者死亡的主要原因，Fas/FasL通路在細胞的增殖、凋亡中發揮重要作用[2]。近年來隨著對腫瘤研究的深入，已經從編碼蛋白RNA層面逐漸延伸到非編碼RNA(lncRNA)。LNCRNs是一類長度超過200個核苷酸的內源性非編碼蛋白質RNA，其在胚胎發育、細胞增殖、細胞分化中發揮重要作用[3]。多項研究表明lncRNA的調控機制與腫瘤的發生、發展相關。lncRNA HOTAIR 在腫瘤的進展中發揮重要作用，其通過重組染色質促進癌轉移[4]；lncRNA TUG1過表達促進宮頸癌細胞增殖和遷移[5]。MAGI2-AS3是近年來新發現的lncRNA，其在乳腺癌中發揮重要作用[6]。但其在神經母細胞瘤中的研究鮮有報道，故本研究通過組織學和分子學機制探究lncRNA MAGI2-AS3在Fas/FasL通路中對神經母細胞瘤的調控作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 材料與儀器 人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y、SK-N-SH均購自中國科學院。MAGI2-AS3慢病毒顆粒(LV-MAGI2-AS3)和對照慢病毒顆粒(LV-NC)購自上海GenePharma Bio。DMEM培養基(美國Thermo Fisher Scientific公司)，胎牛血清(FBS，美國Gibco-BR)，胰蛋白酶(美國Difo公司)，DMSO(美國Amresco公司)，Trizol試劑盒、RNA反轉錄試劑盒(中國大連TaKaRa公司)，SYBR Prime Script RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，BCA蛋白試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，PVDF微孔濾膜(美國Bio-Rad 公司)，β-肌動蛋白抗體(美國ABcam公司)，Fas抗體、FasL抗體(美國Proteintech公司)，二抗辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG(美國Pierce公司)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，上海生物技術研究所)，多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)，FACS流式細胞儀(美國BD公司)，CO2恒溫培養箱(美國Thermo公司)，凝膠成像系統(美國UVP公司)，離心機、熒光定量儀(德國Eppendorf公司)。

1.1.2 臨床資料 本研究選用2016年1月至2018年6月在本院接受治療的23例神經母細胞瘤患者為研究對象，其中男11例，女12例，年齡5個月～14歲，平均(4.15±3.06)歲；按照國際神經母細胞瘤分期系統進行臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期8例，Ⅲ～Ⅳ期15例。手術采集患者癌組織和癌旁正常組織，采集后比標號所有組織樣本保存于液氮中。經醫院倫理委員會批準同意，所有患者及監護人均知情同意且簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與慢病毒處理 人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y、SK-N-SH培養在含有10%胎牛血清的DMEM完全培養液中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，當細胞融合度達到80%左右時，棄掉培養基，適量PBS清洗，使用0.25% 的胰蛋白酶進行消化，消化完成后用含有10%胎牛血清的DMEM終止消化，1 000 r/min離心收集細胞，接種到25 cm2細胞培養瓶中繼續培養，每2 d換液，3～4 d傳代，穩定傳代2～3代，收集對數期細胞進行實驗。

收集對數期的SH-SY5Y、SK-N-SH細胞，每種細胞分為3組，每組做3個重復，control組(control)未轉染慢病毒顆粒，LV-NC組為轉染空載，LV-MAGI2-AS3組為轉染MAGI2-AS3慢病毒顆粒，轉染步驟按照說明書進行。在病毒轉染前用5 μg/ml聚丁烯(GenePharma Bio)處理80%融合細胞，1 d后轉入新鮮培養基。轉染后細胞于37℃、5%CO2培養箱繼續培養，收集轉染后0、24、48、72 h的細胞熒光顯微鏡檢測轉染效率。

1.2.2 qRT-PCR檢測組織(細胞)中mRNA的表達 收集轉染后各細胞系對數期細胞，用Trizol法抽提組織(細胞)總RNA，反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，熒光定量PCR儀進行qRT-PCR檢測各細胞系MAGI2-AS3、Fas、FasL mRNA相對表達量。SYBR Green法qRT-PCR反應體系為25 μl：SYBR GreenⅡMaster Mix 12 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O補足25 μl；參數設置為95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個循環。以β-actin為管家基因。采用Primer Premier5.0 設計引物，由上海生工合成，引物序列見表1。

1.2.3 細胞增殖情況的檢測 采用CCK-8方法檢測細胞增殖情況。收集各組細胞懸液于96孔板中(100 μl/孔)，每組設置3個平行對照，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在37℃、5%CO2培養箱中繼續培養4 h，使用酶標儀檢測450 nm處的吸光值，分析細胞增殖情況。

1.2.4 細胞凋亡的檢測 采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。胰蛋白酶進行消化，室溫2 000 r/min離心5 min收集各組細胞；PBS洗滌細胞2次，調整細胞為1×106ml-1；吸取1 ml細胞懸浮液，加入 500 μl 的結合緩沖液混合，上機前加入5 μl碘化丙啶(PI)和 5 μl 膜聯蛋白-V(Annexin-V)，室溫避光反應10 min，1 h內使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2 結果

2.1 lncRNA MAGI2-AS3、Fas、FasL mRNA在神經母細胞瘤組織中的表達 對23例神經母細胞瘤患者進行qRT-PCR檢測癌組織和正常組織的MAGI2-AS3表達水平。結果顯示，MAGI2-AS3 mRNA在神經母細胞瘤組織中的表達顯著低于相對應的正常組織(圖1A)。對Fas、FasL mRNA表達水平進行檢測，結果發現神經母細胞瘤組織Fas、FasL mRNA表達較正常組織均顯著降低(圖1B、C)，見表2。

2.2 lncRNA MAGI2-AS3的表達與神經母細胞瘤患者臨床病理參數的關系 根據lncRNA MAGI2-AS3表達水平的中位值分為高表達組共16例，低表達組共7例，觀察lncRNA MAGI2-AS3表達與神經母細胞瘤患者臨床病理參數的關系，結果顯示lncRNA MAGI2-AS3與臨床分期、組織分化程度有關，差異均具有統計學意義(P<0.05)，與年齡、腫瘤大小、浸潤深度無顯著相關。詳見表3。

2.3 轉染效率的檢測 采用轉染慢病毒上調SK-N-SH、SH-SY5Y 兩個神經母細胞瘤細胞系中MAGI2-AS3表達水平，用熒光顯微鏡法測定感染效率，結果表明轉染MAGI2-AS3慢病毒(LV-MAGI2-AS3)可顯著提高MAGI2-AS3在神經母細胞中的表達(圖2A、B)。qRT-PCR檢測結果顯示轉染LV-MAGI2-AS3的MAGI2-AS3表達水平顯著高于轉染LV-NC和control組。

表1 引物信息

Tab.1 Primer information

GeneForward primer(5'-3')Reverse primer(5'-3')β-actinGGTCTCAAACATGATCTGGGGGGTCAGAAGGACTCCTATGMAGI2-AS3CACCTTGCTTGACAACTTGACATTACAGCTCGGCTACTGCFasCTGGATTTAGGAATTGCTCTTGTCAGGTGGTTCCAGGTATCTGCTTCAFasLTGCACACAGCATCATCTTTGGAAGGCATGGACCTTGAGTTGGAC

圖1 lncRNA MAGI2-AS3、Fas、FasL mRNA在組織中的表達水平Fig.1 Expression of lncRNA MAGI2-AS3,Fas and FasL mRNA in tissuesNote: ***.P<0.001.

表2 lncRNA MAGI2-AS3、Fas、FasL mRNA在組織中的表達水平

Tab.2 Expression of lncRNA MAGI2-AS3,Fas and FasL mRNA in tissues

GroupsnMAGI2-AS3FasFasL Normal group231.02±0.291.01±0.310.91±0.28Colon cancer group23 0.48±0.211)0.52±0.201)0.50±0.181)

Note：Compared with the normal group,1)P<0.001.

表3 lncRNA MAGI2-AS3的表達與患者臨床病理特征的關系[例(%)]

Tab.3 Relationship between expression of lncRNA MAG-I2-AS3 and clinicopathological features of patients[n(%)]

圖2 lncRNA MAGI2-AS3的過表達情況和lncRNA MAGI2-AS3 mRNA的表達水平(×400)

Fig.2 Overexpression of lncRNA MAGI2-AS3 and express-ion level of lncRNA MAGI2-AS3(×400)

Note: ***.P<0.001.

圖3 過表達lncRNA MAGI2-AS3對Fas、FasL mRNA表達水平的影響Fig.3 Effects of overexpression of lncRNA MAGI2-AS3 on Fas and FasL mRNA expression levelsNote: ***.P<0.001.

2.4 過表達LncRNA MAGI2-AS3對神經母細胞瘤細胞Fas、FasL mRNA的影響 qRT-PCR檢測過表達LncRNA MAGI2-AS3對SK-N-SH、SH-SY5Y細胞系中Fas、FasL mRNA表達的影響，結果顯示，過表達 LncRNA MAGI2-AS3后Fas、FasL mRNA表達水平顯著高于LV-NC組和control組(圖3A、B)，Fas/FasL是腫瘤發生過程中的關鍵調控因子，由結果表明MAGI2-AS3可能通過抑制Fas/FasL信號轉導抑制神經母細胞瘤細胞增殖。

2.5 過表達LncRNA MAGI2-AS3對神經母細胞瘤細胞增殖的影響 CCK-8檢測過表達LncRNA MAGI2-AS3后，SK-N-SH、SH-SY5Y細胞系的增殖情況，結果顯示，感染LV-MAGI2-AS3的兩個細胞系增殖率均顯著降低，顯著低于LV-NC組和control組，LV-NC組和control組無顯著變化(圖4A、B)。

圖4 過表達lncRNA MAGI2-AS3對神經母細胞瘤增殖的影響Fig.4 Effect of overexpression of lncRNA MAGI2-AS3 on proliferation of neuroblastomaNote: **.P<0.05,***.P<0.001.

表4 各組細胞凋亡率比較

Tab.4 Comparison of apoptotic rate in each group

GroupsSK-N-SHSH-SY5YControl6.38±1.106.65±1.22LV-NC7.16±1.217.32±1.26LV-MAGI2-AS312.68±2.431)2)13.16±2.441)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with LV-NC group,2)P<0.05.

2.6 過表達LncRNA MAGI2-AS3對神經母細胞瘤細胞凋亡的影響 三組細胞凋亡率組進行比較，結果顯示LV-MAGI2-AS3z組細胞凋亡率顯著高于LV-NC組和control組，LV-NC組和control組凋亡率比較無顯著差異。詳見表4。

3 討論

神經母細胞瘤是兒童較為常見的交感神經系統的惡性腫瘤，其發病率在世界范圍內正在增加。目前對腫瘤的治療主要是外科手術和化療，來延長患兒的生存時間，但治療方式具有嚴重的副作用。研究發現，多種基因與神經母細胞瘤的發生發展相關，且腫瘤細胞的生長不僅與細胞增殖相關，還與細胞異常凋亡密切相關[7]。近年來發現，LncRNA的失調可能影響表觀遺傳信息，促進細胞的無限增長，進而導致腫瘤的生成[8]。但是LncRNA影響腫瘤的分子機制尚不清楚，因此LncRNA在腫瘤發生發展中的作用備受關注。

基因調控對癌細胞活性具有重要作用，LncRNA可以調節腫瘤細胞的生物活性。特別是癌癥的轉錄和轉錄后水平[9,10]。Liu 等[11]研究發現lncRNA GHET1通過上皮間質轉變(Epithelial mesenchymal transition)促進食管鱗癌細胞的增殖。Yu 等[12]報道，HOXA11-AS通過調節LATS1的表達促進肝細胞癌增殖。MAGI2是一種具有募集和錨定作用的支架蛋白，研究發現，MAGI2在腦組織中高表達，且是一種潛在的腫瘤抑制因子。研究報道，MAGI2抑制肝癌細胞的增殖、遷移及促進其凋亡[13]。Yang等[14]報道，lncRNA MAGI2-AS3 通過抑制乳腺癌細胞的增殖。本研究通過對神經母細胞瘤患者的腫瘤組織和正常組織的檢測發現，lncRNA MAGI2-AS3在腫瘤組織中的表達顯著低于正常組織，且Fas、FasL的表達也處于低水平，這表明神經母細胞瘤患者的腫瘤組織中lncRNA MAGI2-AS3處于低表達水平。還研究了MAGI2-AS3表達與神經母細胞瘤患者臨床病理參數之間的關系，結果表明lncRNA MAGI2-AS3與臨床分期、組織分化程度有關，且呈負相關。通過臨床參數和組織檢測發現lncRNA MAGI2-AS3在神經母細胞瘤中具有重要作用。

為了進一步研究MAGI2-AS3在神經母細胞瘤中的作用，我們用LV-MAGI2-AS3轉染神經母細胞瘤細胞，以上調MAGI2-AS3的表達，結果顯示MAGI2-AS3表達上調。Fas是腫瘤壞死因子受體家族的細胞表面受體，通過與腫瘤壞死因子天然配體FasL相互作用，啟動外源性凋亡途徑誘導細胞凋亡，Fas/FasL途徑是細胞凋亡的關鍵調控因子[15,16]。因此，Fas/FasL通路在腫瘤抑制中起著重要的作用[17]。Zhang等[18]研究報道，LncRNA LIcN900152通過調控Fas表達誘導細胞凋亡，降低CSC細胞的存活率。lncRNA MAGI2-AS3 通過調控Fas/FasL通路促進乳腺癌細胞的凋亡。石萌等[19]報道，miRNA 通過Fas調控胃腸道腫瘤的凋亡。趙國棟等[20]報道，Fas/FasL信號通路在PBDE-47誘導的SH-SY5Y細胞凋亡中具有重要作用。為了進一步闡明MAGI2-AS3抑制神經母細胞瘤細胞生長的機制，我們對Fas、FasL mRNA的表達進行檢測，發現過表達MAGI2-AS3后Fas、FasL mRNA表達水平也顯著升高，表明MAGI2-AS3調節Fas和FasL的表達，激活MAGI2-AS3可以導致Fas/FasL通路的激活。且過表達后MAGI2-AS3后，CCK-8檢測發現細胞增殖率顯著低于LV-NC和control組，通過流式細胞儀檢測發現細胞凋亡率顯著高于LV-NC和control組。根據這些結果表明，MAGI2-AS3在腫瘤組織中低表達，且其抑制Fas、FasL mRNA的表達，其可能是通過Fas/FasL信號通路而潛在地抑制神經母細胞瘤的生長。

綜上所述，lncRNA MAGI2-AS3、Fas、FasL在神經母細胞瘤組織和細胞系中均低表達，過表達lncRNA MAGI2-AS3引起Fas、FasL的表達上調，表明MAGI2-AS3可能通過抑制Fas/FasL信號通路而潛在地抑制神經母細胞瘤的生長，但是其具體的作用機制有待進一步研究。