調節性T細胞參與ANCA相關血管炎的發病機制

劉春麗 商 瑋 蔡 輝

(東部戰區總醫院，南京210002)

抗中性粒細胞胞漿抗體相關血管炎(Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated vascul-itides，AAV)主要是以中小血管系統性炎癥為主要特征的疾病。根據臨床和組織病理學特征主要分為以下三類:①肉芽腫性多血管炎(Granulomatosis with polyangiitis，GPA)，②顯微鏡下多血管炎，③嗜酸性粒細胞肉芽腫性多血管炎[1]。免疫調節細胞的功能缺陷，抑制自身免疫反應的失敗，打破自身耐受是AAV發病的主要原因[2]。調節性T細胞(regulatory T cells，Tregs)是維持外周免疫耐受必需的重要細胞，是阻止自身免疫的關鍵T細胞亞群，參與AAV的免疫調節功能已經得到逐步證實[3]，本文就AAV發病中T細胞可能的參與機制進行綜述。

1 AAV中T細胞的持續活化

盡管在AAV的效應階段抗中性粒細胞胞漿抗體(Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody，ANCA)發揮中心性作用，然而并不能排除T細胞的致病作用。疾病早期反復暴露于同一種抗原以及Tregs的功能障礙，均能導致AAV中T細胞的持續激活。在AAV受損的器官中均可檢測到活化的T細胞，持續活化的T細胞數量與疾病的嚴重程度呈正相關[4]。

在GPA中，CD4+T輔助(T helper，Th)細胞的免疫病理學作用取決于疾病是局限性還是系統性。早期針對GPA患者的研究主要集中在Th1和Th2細胞之間的平衡關系。活動期的GPA患者CD4+T細胞主要表達Th1細胞相關標志物，進一步發現局部病變的患者外周循環和鼻肉芽腫組織中Th1相關標志物占主導地位，而系統性病變患者中Th2相關標志物則更為突出。最近證實在GPA患者中抗原特異性Th17細胞擴增，與疾病活動性和是否維持藥物治療無關[5]。活動性GPA患者中血清白介素-17(Interleukin-17，IL-17)水平升高，當進入緩解期時仍然維持在較高水平。利用蛋白酶3(Proteinase 3，PR3)體外刺激GPA患者的外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)能夠導致IL-17和Th17細胞的轉錄因子RORγt表達增加，表明Th17細胞很可能參與AAV的免疫發病[6]。

2 AAV中啟動和維持T細胞活化的機制

AAV中T細胞活化的啟動和維持機制尚不清楚，有研究表明Tregs免疫抑制功能失常，免疫調節的打亂可能是維持AAV中T細胞持續活化的重要因素。

2.1 Tregs分子表型 40多年前首次發現T細胞具有免疫抑制能力，直到1995年才發現一類表達IL-2受體α鏈(CD25)的CD4+Th細胞亞群是阻止自身免疫反應的關鍵。敲除野生型小鼠的CD4+CD25+T細胞并將剩下的T細胞轉染同源無胸腺小鼠體內能夠誘導發生自身免疫和多器官損傷，當將CD4+CD25+T細胞回輸后能夠阻止自身免疫的發生[7]。隨后在人體內也發現相似的CD4+抑制性T細胞或Tregs。共同培養CD4+CD25hiT細胞和CD4+CD25-反應性T細胞，發現CD4+CD25hiT細胞能夠直接抑制CD4+CD25-反應性T細胞的增生和細胞因子形成。這些結果均表明Tregs表型CD4+CD25+的存在[8]。隨后發現在Tregs表達的關鍵標記物轉錄因子FoxP3能將其與其他CD4+T細胞區分開來。首先在scurfy小鼠品系中檢測到FoxP3編碼scurfin蛋白，FoxP3基因的X連鎖隱性突變導致16～25 d齡的半合子雄性小鼠死亡，淋巴細胞顯示過度增殖，多個器官中CD4+T細胞浸潤并產生大量細胞因子[9]。X連鎖綜合征(即IPEX)患者也存在FoxP3的突變，主要以免疫調節失衡、內分泌失調和腸道疾病為主要特征。此外一些研究顯示scurfy小鼠和IPEX患者不存在CD4+CD25+Tregs。利用逆轉錄病毒將FoxP3轉染至幼稚CD25-CD4+T細胞中能夠誘導T細胞的產生，其在表型上和功能上類似于Tregs。以上結果表明FoxP3對于Treg的成熟和功能的發揮是必需的。根據幼稚和記憶CD4+Th細胞中FoxP3的表達水平不同，人外周血FoxP3+CD4+T細胞分為CD45RA+FoxP3lo靜息Tregs(CD45RA+FoxP3loresting Tregs，rTregs)，CD45RA-FoxP3hi活化Tregs(CD45RA-FoxP3hiactivated Tregs，aTregs)和分泌IFNγ-和IL-2的CD45RA-FoxP3loCD25+Tregs三種類型。前兩者(即rTregs和aTregs)在體外就能夠發揮有效的抑制功能，而CD45RA-FoxP3loCD25+Tregs卻不能。這表明僅憑FoxP3不能定義真正的抑制性Tregs。已有研究發現人Tregs存在幾種不同的FoxP3亞型。第一種亞型是全長型FoxP3(Full-length FoxP3，FoxP3fl)，第二種亞型缺少外顯子2型(Lacking exon 2，FoxP3Δ2)。不同的FoxP3亞型影響Tregs功能和分類。FoxP3fl與RORγt(Th17細胞的轉錄因子)相互作用并抑制Th17細胞基因的表達，而FoxP3Δ2型卻不能。Tregs和Th17細胞的發育相互影響[10]。在體外中性條件下，β型轉化生長因子(Transforming growth factor β，TGFβ)將平衡傾向功能性FoxP3+Tregs方向發展，而在炎性細胞因子IL-1β、IL-2、IL-15等存在下，功能性Tregs向產生IL-17的非功能性Tregs轉化。因此，FoxP3結合CD25、CD45RA的表達對定義真正抑制性Tregs至關重要。

2.2 Tregs和作用機制 Tregs調節免疫的確切機制尚不清楚，可能通過分泌抗炎細胞因子、細胞溶解、代謝紊亂和調節樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)的成熟和功能的發揮等不同機制作用的。Tregs能夠產生大量細胞炎性因子如IL-10、IL-35和轉化生長因子(Transforming growth factor β，TGF-β)抑制免疫細胞活化；Tregs釋放酶(顆粒酶A或B)通過促進細胞溶解是誘導效應細胞凋亡的另一種機制；代謝紊亂，如當IL-2缺乏時誘導效應細胞死亡，Tregs還能夠通過縫隙連接將可溶性介質環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)轉移到靶細胞效應T細胞和DC中來抑制效應細胞功能發揮。在靶細胞中，cAMP誘導抑制細胞增殖和IL-2產生的誘導型cAMP早期阻遏物(Inducible cAMP early repressor，ICER)形成。最后，Tregs通過抑制性表面分子淋巴細胞活化基因(Lymphocyte activation gene，LAG)3和毒性T淋巴細胞相關抗原(Cytotoxic T lymphocyte-associated Ag，CTLA)-4調節DC成熟。當DC感知到這些分子的存在時，開始產生吲哚胺2，3-雙加氧酶反過來抑制其他免疫細胞[11]。Tregs引發抑制的機制取決于抗原的劑量。高劑量抗原通過誘導Fas介導的細胞凋亡或T細胞受體(T cell receptor，TCR)連接引發有效抑制效應，這兩者都導致T細胞無反應性，而低劑量抗原僅誘導IL-10或TGF-β的分泌[12]。Tregs可以通過抑制協同刺激因子作用和分泌抗炎細胞因子來抑制效應T細胞的活化以預防自身免疫[13]。在移植物抗宿主病中的研究發現，擴增的Treg對單核細胞的作用導致促炎細胞因子IL-6、TNF-α的產生和NF-κB活化的減少。此外，單核細胞與擴增的Tregs共同培養后共刺激因子和MHCⅡ類分子的表達下調，M2巨噬細胞特異性標志物、CD206、血紅素加氧酶-1、IL-10的產生增加。與擴增的Treg共培養的單核細胞能夠使產生IL-17的T細胞能力降低，這種促炎性Th17擴增能力的減少是共刺激分子CD86低表達所導致的。因此，擴增的Treg具有誘導單核細胞表型和功能變化的能力，這可能對移植中的耐受誘導、移植物抗宿主病和自身免疫疾病的預防和治療至關重要[14]。總之，Tregs采用多種機制發揮其免疫抑制作用，并在抑制自身免疫反應中發揮關鍵作用。

2.3 AAV中的Tregs 在AAV中，Tregs免疫抑制功能的缺陷導致免疫細胞持續活化和慢性自身免疫炎癥的發展。關于AAV免疫調節的研究多集中在Tregs的異常功能和/或比例改變上。盡管大多數研究都認為在AAV中Tregs的免疫抑制作用受損，主要是由數值或功能變化引起還是兩者共同作用尚存在爭議。

2.3.1 AAV中Tregs的比率和功能改變 關于AAV中Tregs的比率存在一些爭議，通過比較緩解期GPA患者與健康人群或其他患者，GPA患者外周血中CD25hiFoxP3+Tregs的比例水平明顯增加，但也有報道指出比率下降。CD4+CD25hiTreg的降低與患者接受的常規免疫抑制治療相關，B細胞清除治療患者的外周循環中Tregs數目與健康者相似，而與常規治療的患者相比顯著增加，而CD4+CD25hiT細胞區域的FoxP3表達未進行評估，盡管通過它能識別出活化的Tregs。另一項研究發現在疾病緩解期(≥1年)Tregs的比率顯著增加，與免疫抑制治療無關。Tregs的比率伴隨著Th2比率的增加而增加，活動性AAV中Tregs數量的減少使得Th17細胞在緩解期擴增，而免疫抑制藥物抑制Th17細胞并允許Tregs擴增導致Th細胞失衡[15]。綜合上述實驗結果表明免疫抑制藥物可恢復緩解期AAV患者的Tregs比例。雖然目前對AAV的Treg比率沒有達成共識，但大部分研究都報道了大多數AAV患者中Tregs的抑制功能出現降低。GPA患者中FoxP3+Tregs的比重增加了，通過其與AAV患者Tregs共培養后反應性T細胞增殖能力增加進而證明其抑制功能減弱。總之，這些結果表明盡管對AAV患者Tregs比重存在爭議，但大多數研究都承認Treg功能減弱的事實。

2.3.2 AAV中Tregs功能障礙的潛在原因 盡管大多數研究顯示AAV患者中Tregs的抑制功能減弱，可能的相關機制包括IL-6介導Tregs與Th17的轉換、降低IL-2的反應性和增加FoxP3剪切變體的表達以及FoxP3啟動子甲基化。炎癥微環境可能誘導Tregs免疫抑制活動降低，如在糖尿病患者中Tregs能轉變為Th1細胞。Th1樣Tregs除FoxP3外還表達Tbet和CXCR3，并分泌IFNγ，表明這些Tregs已失去其免疫抑制功能[16]。當用同種異體抗原呈遞細胞，尤其是單核細胞刺激時，CD25hiFoxP3+T細胞可以轉化為產生IL-17的T細胞，外源性IL-1β、IL-23和IL-21能夠增強這種轉化，而IL-6或TGF-β卻不能[17]。類風濕關節炎(RA)和癌癥患者炎癥部位FoxP3的Th17樣Tregs表達更豐富。而在AAV中，炎癥部位Tregs也似乎更傾向于產生IL-17，這些可能是由于炎癥微環境中IL-6和TGF-β的產生增加造成的。炎癥部位Tregs免疫抑制能力的下降可能與暴露于IL-6和TGF-β有關。AAV患者Th17水平升高和Treg功能減弱，表明這種機制可能也參與AAV的發病。IL-6似乎發揮更重要的作用，當暴露于IL-6時，Tregs失去其抑制功能，同時支持Tregs的抑制功能的轉錄因子Helios表達水平也降低。單克隆抗體Tocilizumab阻斷IL-6受體的RA患者，與未阻斷治療者、健康對照者相比，Helios+FoxP3+CD4+T細胞的比例增加[18]。在AAV中，炎癥局部高水平IL-6促進Tregs向產生IL-17的T細胞轉化，抑制功能喪失，進而導致持續的效應細胞活化。AAV中Tregs的抑制能力下降可能與IL-2的反應性降低有關。與健康對照者相比，AAV患者中活化的Th細胞和Tregs上IL-2受體(IL-2R，CD122)β鏈表達顯著降低[19]。IL-2是一種細胞因子，Tregs在穩態和炎癥條件下功能的發揮都需要它。當Tregs對IL-2的反應能力下降時可能不會發揮其抑制功能[20]。

FoxP3亞型的異常表達可能是AAV中Tregs功能異常的原因。FoxP3fl與RORγt相互作用并抑制Th17細胞基因的表達，而FoxP3Δ2卻不能。因此，FoxP3Δ2可能導致Tregs中RORγt的顯性表達，從而導致IL-17的產生，并將Tregs向致病性Th17細胞轉化。與健康對照者相比，活性和非活性AAV患者中Th細胞中的FoxP3Δ2型均增加，FoxP3fl比例卻降低。AAV患者Tregs抑制能力的下降程度與缺乏外顯子2型Tregs的比例呈正相關[21]。總之，FoxP3的剪接變體的表達可能是抑制功能降低的原因。

Tregs的表觀遺傳學異常也是AAV中Tregs抑制活性下降的原因。FoxP3啟動子中的CpG基序，也稱為Treg特異性去甲基化域(Treg-specific demethylated region，TSDR)，去甲基化后才能導致FoxP3基因轉錄[22]。在靜息態的常規T細胞中，該基序僅輕微發生去甲基化。乙酰化組蛋白與Tregs中的FoxP3啟動子較常規T細胞關聯性更強，這可能使得FoxP3啟動子更容易接近RNA聚合酶，Tregs中FoxP3特異性轉錄，激活Tregs抑制功能。失活的Tregs不表達FoxP3，抑制活性下降，這些均與去甲基化TSDR相關[23]。AAV中的組蛋白乙酰化程度是否較低，以及是否增加FoxP3啟動子的甲基化并導致更多的無活性Treg產生需要進一步研究。盡管上述這些可能與AAV中Tregs的抑制能力降低有關。然而，其在AAV中受損的確切機制仍有待進一步研究。

總之，AAV免疫調節細胞亞群的數值和功能改變，自身反應性T細胞的清除和充分抑制的失敗，導致針對自身蛋白免疫應答的啟動和蔓延，自身反應性效應T細胞的不斷增殖和致病性自身抗體產生。盡管存在研究之間的差異，但在大多數研究中發現Tregs的抑制功能減弱。T細胞中效應細胞和調節細胞之間的失衡是AAV發病機制的一個重要方面，這表明當構建恢復這種平衡時對AAV患者有顯著的益處。