首例獸用活疫苗中污染副流感病毒5型的檢測(cè)

吳華偉，秦義嫻，陳曉春，曹明慧，林梓棟，鄧 永，劉 丹

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣州 010030)

副流感病毒5型(Parainfluenza virus 5，PIV5)為單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA病毒，屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)。1954年首先在原代猴腎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)猴病毒5型(Simian virus 5，SV5)[1]。不同宿主可分離到該病毒，如人類、豬、牛、犬、貓、虎和小熊貓等[1-3]。我國(guó)近幾年陸續(xù)報(bào)道在牛群和豬體中也檢測(cè)出PIV5[4-5]。近期，在對(duì)某企業(yè)送檢的豬偽狂犬活疫苗進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)疑似血凝性外源病毒污染，經(jīng)病原學(xué)和分子生物學(xué)驗(yàn)證，證實(shí)該批產(chǎn)品污染了PIV5，這也是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道生物制品中污染了PIV5。此外，還對(duì)我國(guó)現(xiàn)有主要的豬用病毒類活疫苗中污染PIV5的情況進(jìn)行了摸底檢測(cè)，以期為加強(qiáng)獸用疫苗中PIV5污染的預(yù)防和控制提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗、細(xì)胞與血清 豬偽狂犬病活疫苗，某公司產(chǎn)品；Vero細(xì)胞和豬偽狂犬病特異性陽性血清，均由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)獸醫(yī)微生物中心提供；PIV5特異性陽性血清，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒室制備。

1.1.2 主要試劑 DMEM營(yíng)養(yǎng)液 ，Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，PAN公司產(chǎn)品；Ex-Taq酶，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；Trizol，Invitrogen公司產(chǎn)品；IPTG、X-gal，購自北京索萊寶科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；T載體和感受態(tài)細(xì)胞，購自Tansgen公司；PIV5單克隆抗體，購自USbiological公司；羊抗小鼠IgG FITC，購自Sigma公司。

1.1.3 主要儀器 PCR儀、電泳儀、紫外成像儀、倒置熒光顯微鏡(萊卡)等。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理與接種 按《中國(guó)獸藥典》三部附錄3305進(jìn)行[6]。隨機(jī)取疫苗3瓶，同批疫苗混勻后，2000～3000 g離心10 min，取上清液加入等體積豬偽狂犬病陽性血清，37 ℃中和作用1 h，接種已長(zhǎng)成良好單層的Vero細(xì)胞(75 cm2)，3 mL/瓶，37 ℃孵育1 h，補(bǔ)加含2%胎牛血清的DMEM維持液至10 mL。置37 ℃ 5%二氧化碳的培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，每天觀察CPE。

1.2.2 F3 代培養(yǎng)物HA效價(jià)測(cè)定 按1.2.1進(jìn)行培養(yǎng)，繼代3次后，3000 r/min離心15 min后，取上清液用PBS(0.1 mol/L，pH 7.0～7.2)作2倍系列稀釋，加入0.5%雞紅細(xì)胞懸液，混合均勻后，置37 ℃孵育 20～40 min，進(jìn)行HA效價(jià)判定，同時(shí)設(shè)立紅細(xì)胞對(duì)照。當(dāng)細(xì)胞對(duì)照孔的紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果，以使紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋度作為判定終點(diǎn)。

1.2.3 病毒分離 按1.2.1進(jìn)行培養(yǎng)，如此盲傳5代，如出現(xiàn)CPE，且經(jīng)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性，則視為病毒分離陽性；如無CPE，且經(jīng)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性，則視為病毒分離陰性。如無CPE，且經(jīng)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性，則繼續(xù)盲傳繼代。

1.2.4 病毒含量測(cè)定 將1.2.3病毒分離株F10代細(xì)胞培養(yǎng)物，3000 r/min離心15 min，取上清液用不含血清的DMEM營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-1～10-88個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種8孔已長(zhǎng)成vero細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞板，每孔0.1 mL，37 ℃吸附1 h，補(bǔ)加2%胎牛血清的DMEM營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)5 d，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，以PIV5單克隆抗體作為一抗(工作濃度1∶200)，以羊抗小鼠IgG FITC作為二抗(工作濃度1∶100)進(jìn)行間接熒光染色，判定是否感染，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.2.5 分離株F10代細(xì)胞培養(yǎng)物HA效價(jià)測(cè)定 將1.2.3病毒分離株F10代細(xì)胞培養(yǎng)物，按1.2.2方法進(jìn)行HA效價(jià)測(cè)定。

1.2.6 純凈性檢測(cè) 將1.2.3病毒分離株F10代細(xì)胞培養(yǎng)物，按照《中國(guó)獸藥典》2015年版三部附錄方法[6]分別進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)。

1.2.7 特異性檢測(cè)

1.2.7.1 間接熒光抗體檢測(cè) 將毒種用DMEM營(yíng)養(yǎng)液稀釋為100 TCID50/0.1 mL，接種96孔板單層Vero細(xì)胞各8孔，每孔100 μL，同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照8孔。接種后在37 ℃下吸附1 h，再補(bǔ)加含2%新生牛血清的DMEM維持液100 μL，置37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h，采用間接熒光抗體法判定結(jié)果。

1.2.7.2 RT-PCR檢測(cè) 根據(jù)GenBank上PIV5相關(guān)序列，設(shè)計(jì)針對(duì)L蛋白的一對(duì)引物：上游引物：5′-CGCCAGCAACAATTACTACC-3′；下游引物：5′-ACAACCCTAATGGGCGTAAC-3′。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，預(yù)期片段為277 bp。

按病毒基因組RNA提取試劑盒說明，從分離毒株的細(xì)胞培養(yǎng)液中提取RNA。按一步法RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系為：模板5 μl，上游引物和下游引物(25 μmol/L)各1 μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1 μL，2×1 Step buffer 12.5 μL，RNase Free dH2O 4.5 μL，混勻后瞬離。反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；最后4 ℃保溫。用1.5%瓊脂糖平板(溴化乙銨終濃度0.5 μg/mL)凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.7.3 基因序列測(cè)定 將1.2.6.2的 PCR產(chǎn)物目的片段的凝膠塊切下后，按商品化DNA凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行DNA回收，克隆到pMD18-T載體上，送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，然后與GenBank中已發(fā)表的8株P(guān)IV5序列進(jìn)行同源性比較。采用的PIV5毒株信息見表1。

水力壓裂技術(shù)產(chǎn)生的裂縫長(zhǎng)度通常可達(dá)100 m,寬度和長(zhǎng)度分別為0.01 m和1 m。為了對(duì)油層進(jìn)行分布式測(cè)量,微納傳感節(jié)點(diǎn)混在攜砂液中(含石英砂)隨壓裂進(jìn)程進(jìn)入裂縫,其在裂縫中的位置因而是隨機(jī)分布的[4]。體積和功率較大的錨節(jié)點(diǎn)通常布置于井筒內(nèi)部,由外部電源供電,可直接與裂縫內(nèi)的傳感器節(jié)點(diǎn)進(jìn)行磁感應(yīng)通信,錨節(jié)點(diǎn)同時(shí)通過磁感應(yīng)方式為傳感節(jié)點(diǎn)提供電能;微納尺寸的傳感器節(jié)點(diǎn)具有全向線圈天線,同時(shí)配置超級(jí)電容器儲(chǔ)存耦合電能。考慮到供電及傳感器通信能力等因素,在面向油藏裂縫的地下無線傳感網(wǎng)絡(luò)中,錨節(jié)點(diǎn)和傳感節(jié)點(diǎn)之間通信(下行鏈路)是單跳方式,傳感節(jié)點(diǎn)與錨節(jié)點(diǎn)之間通信(上行鏈路)采用多跳方式[5]。

表1 序列分析用PIV5參考毒株Tab 1 PIV5 reference strains for sequence analysis

1.2.8 豬用活疫苗中污染PIV5情況摸底檢測(cè) 隨機(jī)選取30批豬用活疫苗(其中豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗20批，豬瘟活疫苗10批)，按照1.2.6.2方法進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，分析現(xiàn)有豬用活疫苗中污染PIV5情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品F3代HA效價(jià)測(cè)定 經(jīng)測(cè)定，以使0.5%紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋度作為判定終點(diǎn)，PIV5 F3代培養(yǎng)物HA效價(jià)為1∶16(圖1)，而正常Vero細(xì)胞上清液和雞紅細(xì)胞對(duì)照均沉淀。

1：Vero細(xì)胞培養(yǎng)物上清液; 2、3: PIV5 F3代培養(yǎng)物；4：0.5%紅細(xì)胞對(duì)照1：The supernatant of normal Vero control；2 and3：The fifth generation PIV5； 4：0.5% chicken red cell suspension control圖1 PIV5 F3代細(xì)胞培養(yǎng)物HA效價(jià)測(cè)定Fig 1 The HA titer result of the third generation PIV5

2.2 病毒分離及RT-PCR結(jié)果 將樣品在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳5代后，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)顆粒增多、圓縮、聚集等CPE(圖2)，而細(xì)胞對(duì)照正常。用設(shè)計(jì)的特異性引物，對(duì)分離培養(yǎng)物F5代進(jìn)行RT-PCR，可擴(kuò)增出277 bp的目的片段(圖3)，擴(kuò)增結(jié)果清晰、無雜帶，而Vero細(xì)胞對(duì)照和陰性對(duì)照均無任何條帶。

A: PIV5 F5在Vero細(xì)胞上產(chǎn)生CPE；B: Vero細(xì)胞對(duì)照A: CPE appeared on Vero cell infected with the fifth generation PIV5；B：Normal Vero control圖2 PIV5 適應(yīng)Vero細(xì)胞病變(10×)Fig 2 The CPE of Vero infected with PIV5(10×)

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: Vero細(xì)胞的PCR產(chǎn)物；2: PIV5 F5代培養(yǎng)物的PCR產(chǎn)物; 3: 陰性對(duì)照M：Protein Marker；1: PCR result of Normal Vero control；2: PCR result of the fifth generation PIV-5；3: PCR result of negative control圖3 PIV5 F5代細(xì)胞培養(yǎng)物PCR鑒定Fig 3 The PCR result of the fifth generation PIV5

2.2 病毒含量及HA效價(jià)測(cè)定結(jié)果 經(jīng)測(cè)定，PIV5 F10代培養(yǎng)物病毒含量為107.0TCID50/mL；以使0.5%紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋度作為判定終點(diǎn)，BPIV-5 F10代培養(yǎng)物HA效價(jià)為1∶256(圖4)，而Vero細(xì)胞對(duì)照上清液和雞紅細(xì)胞對(duì)照均沉淀。

1、2：PIV-5 F10代培養(yǎng)物；3：Vero細(xì)胞培養(yǎng)物上清液；4：0.5%紅細(xì)胞對(duì)照1 and 2：The fifth generation PIV5；3：The supernatant of normal Vero control； 4：0.5% chicken red cell suspension圖4 PIV5 F10代細(xì)胞培養(yǎng)物HA效價(jià)測(cè)定Fig 4 The HA titer result of the 10th generation PIV5

2.3 純凈性檢測(cè) 按照2015年版《中國(guó)獸藥典》三部附錄方法進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)，結(jié)果為無菌生長(zhǎng)、無支原體生長(zhǎng)和無外源病毒污染，說明該分離毒株純凈性良好。

2.4 特異性檢驗(yàn)

2.4.1 IFA檢測(cè) 將分離的PIV5培養(yǎng)物在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)96 h，然后以PIV5 單抗為一抗(工作濃度1∶200)，以羊抗鼠IgG FITC二抗(工作濃度1∶100)進(jìn)行染色，在感染細(xì)胞的胞漿可觀察到典型的綠色熒光(圖5 A)，而細(xì)胞對(duì)照未出現(xiàn)綠色熒光(圖5B)。

A：PIV5感染Vero ；B：Vero對(duì)照A: Virus infected Vero cell；B: Vero cell control圖5 IFA染色結(jié)果(10×) Fig 5 The result of IFA(10×)

2.4.2 RT-PCR結(jié)果 用設(shè)計(jì)的特異性引物，對(duì)分離培養(yǎng)物F10代進(jìn)行RT-PCR，可擴(kuò)增出277 bp的目的片段(圖6)，擴(kuò)增結(jié)果清晰、無雜帶，而Vero細(xì)胞對(duì)照和陰性對(duì)照均無任何條帶。

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 陰性對(duì)照；2：Vero細(xì)胞的PCR產(chǎn)物；3: PIV5 F10代培養(yǎng)物的PCR產(chǎn)物M：Protein Marker；1: PCR result of negative control 2: PCR result of normal Vero control3: PCR result of the tenth generation PIV5圖6 PIV5 F10代細(xì)胞培養(yǎng)物的PCR鑒定Fig 6 The PCR result of the tenth generation PIV5

2.4.3 基因序列測(cè)定 將所測(cè)的目的片段與GenBank中已發(fā)表的8株P(guān)IV5 的L基因序列進(jìn)行同源性比較，同源性為93.1%～97.4%(圖7)。其中與我國(guó)分離的來自小熊貓的PIV5 ZJQ-221株(登陸號(hào)：KF100034.1)同源關(guān)系最近，為97.4%；其次與犬源、猴源、牛源的PIV5同源性均在95.5%以上，與豬源的PIV5同源性為93.3%～95.9%，同源性均較高。基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示同樣的結(jié)果(圖8)。

圖7 PIV5/01株與GenBank中L基因序列同源性比較結(jié)果Fig 7 Homology analysis between PIV5 and the sequences from GenBank

圖8 PIV5/01株與GenBank中PIV5基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig 8 Phylogenetic analysis of PI-5 and sequences from GenBank

3 豬用活疫苗中污染PIV5情況檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)對(duì)30批豬用病毒類活疫苗進(jìn)行PIV5污染情況調(diào)查，共檢出5批陽性樣品(圖9)，陽性率為16.7%(5/30)，其中豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗檢出3批，陽性率為10%(2/20)；豬瘟活疫苗檢出3批，陽性率為30%(3/10)，顯示現(xiàn)有豬用活疫苗PIV5污染風(fēng)險(xiǎn)較高。

4 討論與結(jié)論

據(jù)報(bào)道，PIV5可以感染包括人類細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞，且在大多數(shù)細(xì)胞中均可獲得高滴度的病毒，其中對(duì)Vero細(xì)胞最為敏感，培養(yǎng)滴度可高于1010PFU/mL[7]。此外，PIV5感染的細(xì)胞也具有較好的紅細(xì)胞吸附作用和紅細(xì)胞凝集作用，可凝集豚鼠、雞、猴等的紅細(xì)胞，尤其以4 ℃對(duì)雞紅細(xì)胞的血凝效價(jià)最高[8]。采用Vero細(xì)胞進(jìn)行豬偽狂犬活疫苗中污染PIV5的分離，并采用雞紅細(xì)胞進(jìn)行HA效價(jià)測(cè)定。結(jié)果顯示，樣品經(jīng)特異性豬偽狂犬陽性血清中和后，連續(xù)繼代5代，即可出現(xiàn)顆粒增多、圓縮、聚集等CPE，且其F10代培養(yǎng)物的病毒含量和HA效價(jià)測(cè)定分別達(dá)到107.0TCID50/mL和1∶256，顯示出良好的細(xì)胞適應(yīng)性。特異性檢測(cè)結(jié)果顯示：采用PIV5單克隆抗體作為一抗進(jìn)行IFA檢測(cè)，可在PIV5感染的Vero細(xì)胞的胞漿中觀察到典型的綠色熒光，這與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的PIV5生命周期中不存在DNA階段，只在感染細(xì)胞的胞漿中增殖相吻合。RT-PCR可擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的片段；序列比對(duì)結(jié)果顯示與GenBank中已發(fā)表的8株P(guān)IV5 的L蛋白序列同源性為93.1%～97.4%，其中與我國(guó)分離的來自小熊貓的PIV5 ZJQ-221株(登陸號(hào)：KF100034.1)同源關(guān)系最近，為97.4%；與犬源、猴源、牛源的PIV5同源性均在95.5%以上，與豬源的PIV5同源性為93.3%～95.9%，均呈現(xiàn)較高的同源性，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析也顯示同樣的結(jié)果。以上病原學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)果均證實(shí)，從某企業(yè)送檢的豬偽狂犬活疫苗中檢出疑似血凝性外源病毒為PIV5。

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-20：20批次PRRSV活疫苗樣品；23-32：10批次CSFV活疫苗樣品；21、33：PIV5/01株陽性對(duì)照；22、34: 陰性對(duì)照M：Protein Marker；1-20：20 batches of PRRSV live vaccines；21-32：10 batches of CSFV live vaccines；21、33：PCR result of positive control；22、34：PCR result of negative control圖9 PRRSV和CSFV活疫苗中PIV5污染情況檢測(cè)Fig 9 The PCR result of PRRSV and CSFV live vaccines

PIV5可感染不同的宿主，我國(guó)近幾年也陸續(xù)有犬、猴、小熊貓、牛群和豬群中分離到PIV5的報(bào)道[2-5]。目前，除犬副流感病毒5型可引起犬呼吸系統(tǒng)或感染性支氣管炎外，陸續(xù)也有PIV5疑似可引起其他動(dòng)物發(fā)病的報(bào)告。Heinen E等[10]2008在德國(guó)一例PRRSV共感染的樣品中分離出一株P(guān)IV5(SER株)，2011年Yu Na Lee等[11]從韓國(guó)出現(xiàn)呼吸癥狀豬的肺臟樣品中分離出KNU-11株P(guān)IV5 2015年Liu等[4]曾報(bào)道，在吉林省白城牛場(chǎng)死于呼吸困難和間質(zhì)性肺炎的犢牛肺組織中分離到一株與豬源KUN-11和SER株高度同源的PIV5(PIV5-BC14株)，由于在健康牛中未檢測(cè)到PIV5，他們據(jù)此推測(cè)犢牛的疾病很有可能是由PIV5-BC14株引起的。2018年Ning Jiang等[5]從中國(guó)4個(gè)省(市)腹瀉相關(guān)豬群的腸道組織中分離到5株與中國(guó)分離的小熊貓?jiān)碯JQ-221株和韓國(guó)分離的犬源1168-1株高度同源的PIV5，但未揭示分離株是否是引起腹瀉的病原。盡管尚未看到除犬之外PIV5能引起其他物種(如人、豬、牛等)致病的明確報(bào)道，但PIV5感染的潛在威脅需引起充分重視。從對(duì)國(guó)內(nèi)主要豬用活疫苗(以豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗和豬瘟活疫苗為代表)PIV5 污染狀況的初步檢測(cè)結(jié)果看，PIV5污染的陽性率約為16.7%，提醒我們必須高度重視獸用疫苗中PIV5 污染的風(fēng)險(xiǎn)，并盡快采取必要措施加以預(yù)防和控制。對(duì)于獸用疫苗中污染PIV5，推測(cè)其主要原因可能有兩個(gè)：一是由于目前我國(guó)豬群、牛群等動(dòng)物中存在PIV5污染，因此來源于感染或隱性感染動(dòng)物或組織制備的細(xì)胞或分離的毒種存在較大的PIV5污染風(fēng)險(xiǎn)，使用它們進(jìn)行疫苗生產(chǎn)有可能造成終產(chǎn)品PIV5污染；二是鑒于目前我國(guó)獸用生物制品使用的牛血清、胰酶、培養(yǎng)基、原代細(xì)胞(或傳代細(xì)胞)等生產(chǎn)用原輔材料的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)不夠全面或部分缺失(如缺少胰酶、DMEM等動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))，造成生產(chǎn)用原輔材料質(zhì)量控制嚴(yán)重缺位，從而可以通過生產(chǎn)環(huán)節(jié)進(jìn)入疫苗成品。從獸用生物制品生產(chǎn)過程看，種毒(特別是新分離的野毒株)、細(xì)胞、胰酶(豬源或牛源)、牛血清等基礎(chǔ)物質(zhì)和材料是目前我國(guó)獸用生物制品外源病毒污染的主要風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)[12]，任何一種材料或幾種材料污染，都有可能造成終產(chǎn)品疫苗中污染PIV5。至于本次獸用疫苗中PIV5污染的主要原因，尚需進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。