氟苯尼考注射液在雞體內殘留消除研究

宋志超，張崇威，陳 薔，朱 雷，邱富娜，吳寧鵬，吳志明

(河南省獸藥飼料監察所，鄭州 450008)

氟苯尼考屬動物專用氯霉素類廣譜抗菌藥物，由美國Schering-Plough公司于1988年研制成功，并在1999年被我國批準為國家二類新獸藥[1]。因其吸收好、體內分布廣、安全高效，并且無再生障礙性貧血的特點，氟苯尼考被廣泛用于治療豬、禽、牛及水產等養殖動物的細菌性疾病[2-4],但氟苯尼考對哺乳動物具有胚胎毒性，人體用藥后還出現厭食、腹瀉等不良反應，長期食用含有氟苯尼考及其代謝物的動物源食品將會對人體產生嚴重的安全隱患[5]。因此，嚴格控制動物源食品中氟苯尼考殘留量、合理制定氟苯尼考休藥期就顯得尤為重要。

本實驗以自制10 mL∶0.5 g氟苯尼考注射液為研究對象，按照《中國獸藥典(2015年版)》獸藥制劑品種說明書范本中有關氟苯尼考注射液的規定給藥，并建立氟苯尼考及氟苯尼考胺的液相色譜-串聯質譜檢測方法。對各個組織中的氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺進行檢測，計算相應休藥期，為正確用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 5%氟苯尼考注射液：自制。氟苯尼考對照品：含量99.3%，批號K0301305，中國獸醫藥品監察所提供；氟苯尼考氘代物對照品：含量98.0%,批號F405751，TRC公司；氟苯尼考胺對照品：含量99.1%，批號262329，Witega公司提供；氟苯尼考氘代物：含量98.0%，批號21-SHG-115-1，TRC公司提供；甲醇、乙腈為色譜純；氨水25%～28%；乙酸乙酯、無水硫酸銨、甲酸銨、氯化鈉、正己烷為分析純。

1.2 儀器設備 Waters Acquity UPLC-Xevo TQ-S液質聯用儀(配電噴霧離子源)；高速冷凍離心機；氮吹儀；分析天平；Milli-Q超純水儀。

1.3 溶液配制 2%氨化乙酸乙酯：取氨水20 mL，加乙酸乙酯980 mL，混勻；4%氯化鈉溶液：取氯化鈉4 g，用水溶解并稀釋至100 mL；4%氯化鈉溶液飽和的正己烷：取一定量4%氯化鈉溶液，加入過量的正己烷，混合，靜止分層；20%甲醇溶液：取甲醇20 mL，加水80 mL，混勻；10 mmol/L甲酸銨溶液：取甲酸銨0.63 g，用水溶解并稀釋至1000 mL。

1.4 試驗動物 白羽雞35只，體重2.5±0.5 kg，購于河南大用實業有限公司。給藥組30只，公母各半，對照組5只，公雞3只，母雞2只。試驗前預飼養1周，期間不給任何抗菌藥物，試驗前后各組飼養條件相同。

1.5 給藥與樣本采集 給藥組按照20 mg/kg(按氟苯尼考計)，肌內注射，每隔48 h給藥1次，連用2次，并于最后一次給藥0(6 h)、1、3、5、7 d分別隨機宰殺6只(給藥組)及1只(空白對照組)，采集胸脯雞肉(非注射部位)、雞全肝、雞全腎、雞皮脂，做好標記，于-20 ℃保存。

1.6 試驗方法 本研究根據具體情況，采用實驗室自建殘留檢測方法對樣品進行測定，內標法定量[6]。

1.6.1 樣品前處理 稱取試樣(2±0.02)g，置于50 mL塑料離心管，添加氟苯尼考及氟苯尼考胺混合內標工作液(50 μg/mL)100 μL，加2%乙酸乙酯-氨水溶液10 mL，渦旋混勻，渦旋振蕩10 min，8000 r/min離心10 min，取上清液于另一離心管中；殘渣用2%乙酸乙酯-氨水溶液10 mL重復提取一次，合并上清液，于50 ℃水浴氮氣吹干。

在殘留物中加入4%氯化鈉溶液3 mL，渦旋使溶解，再加入4%氯化鈉溶液飽和的正己烷5 mL，渦旋混合30 s，8000 r/min離心5 min，棄去正己烷，用5 mL 4%氯化鈉溶液飽和正己烷重復脫脂一次。在下層水相中加入2%乙酸乙酯-氨水溶液5 mL，渦旋振蕩5 min，8000 r/min離心5 min，吸取上層有機相于10 mL離心管中，殘渣用2%乙酸乙酯-氨水溶液5 mL重復萃取一次，合并有機相，50 ℃水浴吹干，殘渣加入20%甲醇溶液1.0 mL，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜供液相色譜-串聯質譜測定。

1.6.2 液相色譜參考條件 色譜柱：C18柱，2.1×100 mm，粒徑1.7 μm，或相當者；流動相A：乙腈，B：水(氟苯尼考及氟苯尼考氘代物)/10 mmol/L的甲酸銨溶液(氟苯尼考胺及氟苯尼考胺氘代物)，梯度洗脫程序見表1；30 ℃；進樣量5 μL。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 Procedure of gradient elution

1為即時變化，6為線性變化

1.6.3 質譜參考條件 離子源：電噴霧(ESI)離子源；掃描方式：正離子(氟苯尼考胺及氟苯尼考胺氘代物)，負離子同時掃描(氟苯尼考及氟苯尼考氘代物)；檢測方式：多反應離子監測(MRM)；電離電壓：負離子模式3.0 kV，正離子模式1.5 kV；錐孔電壓：負離子模式20 V，正離子模式8 V；源溫：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；錐孔氣流速：150 L/h；脫溶劑氣流速：1000 L/h；定性、定量離子對、離子源、錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 定性、定量離子及對應的錐孔電壓和碰撞能量Tab 2 Qualitative and quantitative ion pair，the corresponding cone volt and collision enerey

標“*”為定量離子對

2 結果與分析

2.1 標準曲線 氟苯尼考在0.5～20 μg/L(內標濃度為5 μg/L)濃度范圍內、氟苯尼考胺在0.5～50 μg/L(內標濃度為5 μg/L)呈現良好的線性關系，其線性方程分別為：y=1.8691x+1.2865和y=0.8570x+0.0166，相關系數R分別為0.9991和0.9999，如圖1及圖2。標準溶液和組織中氟苯尼考及氟苯尼考胺色譜圖見圖3及圖4。

2.2 組織中藥物殘留及消除規律 按照實驗室自建方法對所采集各組雞肉、雞肝、雞腎、雞皮脂中氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺進行檢測，內標法定量。不同時間點各殘留量見表3及表4，殘留消除曲線見圖5、圖6。

圖2 氟苯尼考胺標準曲線Fig 2 Standard curve of florfenicol amine

圖3 氟苯尼考及氟苯尼考胺混合標準溶液色譜圖Fig 3 Chromatogram of mixed standard solution of florfenicol and florfenicol amine

圖4 雞腎中殘留的氟苯尼考及氟苯尼考胺色譜圖(休藥后第0天)Fig 4 Chromatogram of florfenicol and florfenicol amine residues in chicken kidney (day 0 after withdrawal)

2.3 休藥期計算 按照農業農村部關于氟苯尼考殘留標示物最大殘留限量[7]和歐盟對休藥期計算的有關規定，用CVMP制定的統計方法(雙單側95%置信區間)，對自制5%氟苯尼考注射液在雞組織中休藥期進行計算。氟苯尼考在各組織中的休藥期見表5，殘留消除擬合圖見圖7～圖10。

表3 不同時間點氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺在雞各組織中殘留量(μg·kg-1)Tab 3 Residues of florfenicol and its metabolite florfenicol amine in chicken tissues at different time (μg·kg-1)

ND為未檢出

表4 停藥期間氟苯尼考胺及氟苯尼考在各組織中的殘留量Tab 4 Residues of florfenicol amine and florfenicol in various tissues during withdrawal

ND為未檢出

圖5 肌肉、皮脂中氟苯尼考胺的殘留消除曲線Fig 5 Depletion curve of florfenicol amine residue in muscle and sebum

圖6 雞肝、雞腎中氟苯尼考胺的殘留消除曲線Fig 6 Depletion curve of florfenicol amine residue in chicken liver and kidney

組織Tissue 肌肉Muscle肝臟Liver腎臟Kidney皮+脂Sebum休藥期/dWithdrawal period3.412.062.251.47

圖7 氟苯尼考注射液在雞肉中殘留消除擬合圖Fig 7 Fitting diagram of depletion of residue of florfenicol injection in chicken

圖8 氟苯尼考注射液在雞腎中殘留消除擬合圖Fig 8 Fitting diagram of depletion of residue of florfenicol injection in kidney

圖9 氟苯尼考注射液在雞肝中殘留消除擬合圖Fig 9 Fitting diagram of depletion of residue of florfenicol injection in liver

圖10 氟苯尼考注射液在雞皮脂中殘留消除擬合圖Fig 10 Fitting diagram of depletion of residue of florfenicol injection in sebum

如表5、圖7～圖10所示，根據WT1.4軟件計算出氟苯尼考在雞肉、肝臟、腎臟、皮脂的休藥期分別為3.14、2.06、2.25、1.47 d。

3 討論與結論

3.1 檢測方法 目前，氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺的檢測方法主要有高效液相色譜法[8-10]、氣相色譜法[11-12]、氣相色譜-質譜聯用法[13-14]、液相色譜-串聯質譜法[15-16]和酶聯免疫法[17]等。由于高效液相色譜靈敏度低，氣相色譜、氣相色譜-質譜聯用法需經衍生化后方能檢測，操作繁瑣，酶聯免疫法準確度低等缺點均無法滿足要求，本研究根據實驗室具體條件，在堿性環境下使以有機鹽形式存在的代謝物以有機分子形式游離出來，并以毒性較小溶解性較好的乙酸乙酯作為提取溶劑，經正己烷脫脂凈化，前處理操作簡便快捷。采用具有高靈敏度的超高效液相色譜-串聯質譜法對氟苯尼考及氟苯尼考胺進行殘留檢測，同時考慮到基質效應對準確度的影響，因此，采用內標法校正，不但使低殘留能被檢測到，同時準確度也大大提高，保證了所得殘留數據的可靠性。

3.2 檢測結果 如表3，圖5、圖6所示，在停藥后第0天(6 h)，雞肉、腎臟、皮脂中的氟苯尼考胺殘留量達到最大值，雞肉中為(203.5±40.52)μg/kg，雞腎中為(993.5±190.07)μg/kg，雞皮脂中為(104.15±14.85)μg/kg。雞肝中氟苯尼考胺在停藥后第1天達到最大值，為(139.18±29.13) μg/kg。雞肉、腎臟、皮脂中的氟苯尼考胺殘留量在停藥后均呈下降趨勢。停藥后第1天各組織中氟苯尼考胺殘留量均低于農業部公布的MRL。停藥第5天時肌肉中檢測不到氟苯尼考胺?？梢姡谕Ｋ幒蟮?天及第1天時，肝臟及腎臟中的氟苯尼考胺殘留量明顯較高，說明氟苯尼考主要經肝、腎代謝及排泄，在停藥后第1天時，肉、腎、皮脂中氟苯尼考胺在雞各組織中均低于50 μg/kg，可見其代謝迅速，以上兩點與丁飛[18]及盧運戰[19]報道結果一致。

3.3 休藥期 有文獻報道[20]，氟苯尼考殘留休藥期計算以氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留量之和為依據，以及給藥療程單劑量20 mg/kg(以氟苯尼考計)連續給藥3 d的情況。本研究按照《中國獸藥典(2015年版)》獸藥制劑品種說明書范本中有關氟苯尼考注射液的給藥規定，以及農業部235公告規定的氟苯尼考殘留標識物為氟苯尼考胺的規定[7]，故本研究給藥量為每次20 mg/kg(以氟苯尼考計)，隔48 h用藥1次，連用2次，在計算氟苯尼考休藥期時以氟苯尼考胺的殘留量為依據。

丁飛[18]以氟苯尼考磺酸鹽注射液按照20 mg/kg對雞進行肌內注射，每天1次，連續給藥3 d，給出推薦休藥期為5 d。與本實驗的以氟苯尼考注射液為研究對象，給藥劑量20 mg/kg，肌內注射，每隔48 h給藥1次，連用2次所計算出的休藥期略有差異，考慮主要是由于給藥劑量、劑型不同等原因造成。

按照20 mg/kg(按氟苯尼考計)，肌內注射，每隔48 h給藥1次，連用2次，建議休藥期為4 d，但考慮到雞各組織內同時存在氟苯尼考及氟苯尼考胺以及其他有害代謝產物，例如氟苯尼考醇和一些未知代謝物形式[21]，給動物性產品的質量安全帶來風險。因此，實際休藥期應高于4 d。