魚腥草芩藍口服液指紋圖譜研究

陸 安，劉炳煒，杜紅娜，郭永國，郭永紅

(1.河北維爾利動物藥業集團有限公司，石家莊 050200； 2.河北省功能性飼料添加劑工程技術研究中心，石家莊 050200；3.石家莊市獸用功能性添加劑工程技術研究中心，石家莊 050200)

魚腥草芩藍口服液處方來源于《國家中成藥標準匯編內科肺系(一)分冊》收載的復方魚腥草合劑[1]，該制劑用于外感風熱引起的咽喉腫痛、急性咽炎、扁桃體炎有風熱癥候者。家禽外感發熱是在機體本身正氣不足的條件下，復感風、寒、燥、暑、濕、火或疫毒之氣，導致營衛失和，臟腑陰陽失調，出現病理性體溫升高，伴有惡寒、禽冠和肉垂紅等為主要臨床表現的一類外感病證。該制劑的治療癥候與家禽外感發熱癥候相似，且炎癥及疼痛模型試驗表明其具有良好的抗炎、鎮痛作用[2]。故將其轉化為國家三類新獸藥(證書編號：(2018)新獸藥證字5號)[3]。該口服液由魚腥草、黃芩、板藍根、連翹、金銀花五味中藥組成，成分復雜，原標準中，只有魚腥草、黃芩、連翹和金銀花的薄層色譜(TLC)鑒別項和黃芩苷的含量測定項，不能全面地反映復方制劑的內在質量。為了更好的控制產品質量，在現有標準的基礎上，增加了指紋圖譜研究項，通過HPLC法建立魚腥草芩藍口服液的指紋圖譜，并對指紋圖譜中的共有色譜峰的藥材來源作了相應歸屬，為全面控制該制劑的質量提供了一個準確可靠的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國 Thermo公司)，DAD檢測器，變色龍工作站； AUW120D 型電子天平(日本 SHIMADZU 公司)；RE-2000A旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(III)循環水式多用真空泵(河南省予華儀器有限公司)。

1.2 試劑與對照品 綠原酸對照品(批號 110753-201415，含量96.2%)，連翹苷對照品(批號 110821-201615，含量94.9%)，精氨酸(批號 140685-201003)，均購于中國食品藥品檢定研究院；黃芩苷對照品(批號 Z0271504，含量95.9%)，購于中國獸醫藥品監察所。乙腈為色譜純；甲醇、磷酸為分析純；水為Milli-Q 超純水。

1.3 藥材 魚腥草、金銀花、黃芩、連翹、板藍根藥材購于安國藥材市場，按《中華人民共和國獸藥典》2015版(Ⅱ部)[4]有關項下規定，檢驗其性狀、顯微特征、薄層色譜、水分、灰分、含量等，均符合規定。

2 方 法

2.1 色譜條件 Thermo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)為流動相梯度，見表1，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長為240 nm，進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 樣品制備方法

2.2.1 魚腥草芩藍口服液樣品制備 取各單味藥材飲片，按配方量準確稱取魚腥草1000 g，黃芩250 g，板藍根250 g，連翹100 g，金銀花100 g，加水煎煮兩次，每次加水10倍量，每次2 h，合并煎液，濾過，使用旋轉蒸發儀，壓力保持在-0.1MPa，60 ℃水浴將濾液濃縮至相對密度為1.18～1.20(60～80 ℃)的清膏，加入乙醇至含醇量為70%，攪勻，室溫靜置24 h，濾過，濾液回收乙醇，回收方法同水煎液濃縮。濃縮至適量，加水至1000 mL，搖勻，濾過，加入0.3%苯甲酸鈉，即得。室溫保存。

2.2.2 單味藥材樣品制備 分別準確稱取魚腥草1000 g、黃芩250 g、板藍根250 g、連翹100 g、金銀花飲片100 g，按2.2.1方法制備單味藥材的口服液，供HPLC分析。

2.3 溶液的制備

2.3.1 魚腥草芩藍口服液供試品溶液的制備 精密量取魚腥草芩藍口服液1 mL，置5 mL量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。進樣前用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜濾過，供HPLC檢測分析。

2.3.2 單味藥材供試品溶液的制備 精密量取各單味藥材口服液1 mL，按2.3.1方法制備各單味藥材供試品溶液。進樣前用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜濾過，供HPLC檢測分析。

2.3.3 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品、綠原酸對照品、連翹苷對照品、精氨酸對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含黃芩苷40.086 μg，綠原酸11.042 μg，連翹苷53.280 μg，精氨酸500.010 μg的溶液，即得。

2.4 樣品分析 分別精密量取10批魚腥草芩藍口服液供試品、各單味藥材口服液供試品及對照品各10 μL，按2.1項下的色譜條件進行分析。

3 結果與分析

3.1 體外成分認定 采用藥材樣品圖譜對比的方法，用相同的色譜條件進行檢測，以保留時間作為鑒定標準，進行色譜峰的指認，并對共有峰進行初步歸屬分析，見圖1～5。由圖1～5可知，(1)初步建立的魚腥草芩藍口服液指紋圖譜有四個成分得到鑒定：綠原酸來源于金銀花和魚腥草；黃芩苷來源于黃芩；連翹苷來源于連翹；精氨酸來源于板藍根。(2)指紋圖譜保留時間在10～29 min共有峰主要來源于魚腥草；10～27 min共有峰主要來源于金銀花；12～34 min共有峰主要來源于黃芩；6～24 min共有峰主要來源于連翹，9～27 min共有峰主要來源于板藍根。

a.綠原酸對照品；b.魚腥草藥材；c.魚腥草芩藍口服液圖1 綠原酸對照品、魚腥草藥材、魚腥草芩藍口服HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of Chlorogenic acid、Houttuynia cordata Thunb、Yuxingcaoqinlan oral liquid

a.綠原酸對照品；d.金銀花藥材；c.魚腥草芩藍口服液圖2 綠原酸對照品、金銀花藥材、魚腥草芩藍口服HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of Chlorogenic acid、Lonicerae Japonicae Flos、Yuxingcaoqinlan oral liquid

e.黃芩苷對照品；f.黃芩藥材；c.魚腥草芩藍口服液圖3 黃芩苷對照品、黃芩藥材、魚腥草芩藍口服HPLC色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms of Baicalin、Scutellaria、Yuxingcaoqinlan oral liquid

g.連翹苷對照品；h.連翹藥材；c.魚腥草芩藍口服液圖4 連翹苷對照品、連翹藥材、魚腥草芩藍口服HPLC色譜圖Fig 4 HPLC chromatograms of Phillyrin、Fororsythia、Yuxingcaoqinlan oral liquid

i.精氨酸對照品；j.板藍根藥材；c.魚腥草芩藍口服液圖5 精氨酸對照品、板藍根藥材、魚腥草芩藍口服HPLC色譜圖Fig 5 HPLC chromatograms of Arginine、Isatidis Radix、Yuxingcaoqinlan oral liquid

3.2 指紋圖譜的建立與分析 根據以上樣品分析結果及建立的10批魚腥草芩藍口服液樣品的色譜圖，見圖6，魚腥草芩藍口服液標示出22個共有峰，在相同色譜條件下，以保留時間作為鑒定標準，參照文獻[5-6]中各生藥譜峰相關性的研究方法，單味藥材及復方色譜圖對比，進行色譜峰的指認，并對該22個共有峰進行了相應的藥材來源歸屬：峰4、9、17、18、19、20、21、22歸屬于黃芩，峰2、4、5、6、7、10、11、12、14歸屬于金銀花，峰13歸屬于板藍根，峰2、4、5、6、14歸屬于魚腥草，峰1、3、6、8、9、10、15歸屬于連翹。經與對照品圖譜(圖7)對比，峰4為綠原酸、峰13為精氨酸，峰15為連翹苷，峰16為黃芩苷。

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2012版)對10批魚腥草芩藍口服液樣品HPLC圖譜進行處理，匹配結果見圖8，以16號峰黃芩苷作為參照確定22個共有峰中的10個共有峰為構成魚腥草芩藍口服液指紋圖譜的特征峰，其保留時間和峰面積為1，各特征峰的相對保留時間及相對峰面積分別列于表2和表3，10批魚腥草芩藍口服液樣品與對照指紋圖譜相似度分別為0.989、0.992、0.981、0.954、0.998、0.998、1.000、0.997、0.997、0.994。

圖6 10批魚腥草芩藍口服液HPLC指紋圖譜共有模式Fig 6 Common pattern of HPLC fingerprint of 10 batches of Yuxingcaoqinlan oral liquid

a.綠原酸；e.黃芩苷；g.連翹苷；i.精氨酸圖7 對照品HPLC圖譜Fig 7 HPLC chromatograms of reference substance

圖8 10批魚腥草芩藍口服液HPLC指紋圖譜縱向疊加圖Fig 8 Vertical overlap of HPLC fingerprint of 10 batches of Yuxingcaoqinlan oral liquid

樣品編號峰號124569131516S20S10.2170.3830.5160.5480.5750.7840.8530.9301.0001.114S20.2180.3820.5140.5470.5760.7810.8500.9371.0001.116S30.2160.3830.5160.5480.5780.7800.8510.9391.0001.109S40.2190.3800.5180.5490.5790.7890.8510.9271.0001.111S50.2150.3810.5160.5460.5770.7880.8520.9331.0001.108S60.2200.3840.5190.5480.5740.7850.8550.9351.0001.121S70.2190.3850.5200.5470.5740.7860.8560.9361.0001.129S80.2180.3850.5150.5460.5780.7870.8550.9371.0001.115S90.2170.3810.5160.5430.5790.7890.8570.9311.0001.125S100.2190.3820.5190.5440.5760.7840.8520.9381.0001.107平均0.2180.3830.5170.5470.5770.7850.8530.9341.0001.116

表3 10批樣品共有指紋峰的峰面積比值Tab 3 Relative peak area of characteristic absorption peaks for the 10 batches of samples

3.3 方法學考察

3.3.1 精密度試驗 取同一批魚腥草芩藍口服液樣品，按樣品溶液制備方法制備供試品溶液，以黃芩苷的峰面積為考察指標，連續進樣6次，RSD值為0.59%(n=6)，表明儀器精密度良好。

3.3.2 穩定性試驗 取同一批魚腥草芩藍口服液樣品，按樣品溶液制備方法制備供試品溶液，以黃芩苷的峰面積為考察指標，分別在0、6、12、18、24 h測定HPLC色譜圖，RSD值為0.83%(n=6)，表明樣品在24 h內穩定。

3.3.3 重復性試驗 取同一批魚腥草芩藍口服液樣品，按樣品溶液制備方法平行操作制備6份供試品溶液，以黃芩苷的峰面積為考察指標，RSD值為1.05%(n=6)，表明方法重復性良好。

4 討論與結論

4.1 色譜條件的選擇與確定 研究過程中對樣品的溶劑及色譜條件中流動相、檢測波長、柱溫、流速進行了嚴格的選擇性考察。

研究表明，50%甲醇溶解的樣品出峰數量多，基線平穩，且峰形較好，因此選用50%甲醇作為供試品溶液所用溶劑。對魚腥草芩藍口服液樣品進行了紫外(200 nm～400 nm)全波長掃描，結果表明，在240 nm下出峰最豐富，峰形最好，其他波長下未見新成分色譜峰，因此選定240 nm為指紋圖譜測定波長。同一條件下考察柱溫對各峰的影響，結果相似，考慮到對色譜柱壽命的影響[7-8]，最后選定25 ℃作為最佳條件。流動相條件優化時分別比較了甲醇-0.4%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液作為流動相的分離效果，結果表明同一條件下甲醇較乙腈對魚腥草芩藍口服液的分離效果好，出峰較多，峰形較好。因此，選擇甲醇-0.4%磷酸水溶液作為流動相。比較甲醇-0.4%磷酸水溶液系統5種不同梯度變化程序，結果表明，按表1梯度程序洗脫，在240 nm波長下色譜峰分離情況較好。考察了上述選定條件下60 min色譜圖，發現50 min后無特征峰出現，故將分析時間定為50 min。

4.2 參照峰的選擇與確定 指紋圖譜中選擇的10個特征峰在色譜圖共有峰中均屬相對含量較大、分離度較好的色譜峰。不僅包括了該制劑大部分原料藥的主要成分，還包括了該制劑現有質量標準中用于質量控制的可控成分黃芩苷、綠原酸、連翹苷和精氨酸，現代藥理研究表明，黃芩中的黃酮類成分是其發揮藥理活性的基礎[9-10]，其中黃芩苷是最主要的活性成分之一，亦具有較好的抗菌、抗病毒、抗炎及抑制免疫作用[11-12]；金銀花和魚腥草中的綠原酸、連翹中的連翹苷也具有良好的抗菌、抗病毒等作用[13-15]，板藍根中的精氨酸能夠參與機體一系列免疫過程[16-18]，其中黃芩苷出峰時間適中且有法定對照品，故選取其作為魚腥草芩藍口服液指紋圖譜的參照峰。

4.3 色譜指紋圖譜的建立和辨認 通過多批次魚腥草芩藍口服液樣品指紋圖譜分析，建立了不同批次魚腥草芩藍口服液的指紋圖譜，并通過單味藥材及復方色譜圖對比，進行色譜峰的指認，對22個共有峰進行了相應的藥材來源歸屬。魚腥草芩藍口服液具有較穩定的特征指紋圖譜，大部分峰形尖銳，分離度好。22個共有峰中源自板藍根的色譜峰較少，僅有1個；其余四味藥材相對均勻分布，源自魚腥草、黃芩、連翹、金銀花的色譜峰個數分別為5、8、7、9，且源自黃芩的相對峰面積明顯大于其他峰面積。

以黃芩苷為參照峰確定了魚腥草芩藍口服液的10個特征峰，并通過相似度評價系統軟件得到10批魚腥草芩藍口服液的對照指紋圖譜及各批樣品與對照指紋圖譜之間的相似度。結果10批樣品相似度分別為0.989、0.992、0.981、0.954、0.998、0.998、1.000、0.997、0.997、0.994，均在0.9以上。

試驗結果表明，魚腥草芩藍口服液體外所含化學成分可以通過指紋圖譜表達，為全面控制該制劑質量奠定了基礎。

4.4 結論 復方中藥口服液成分復雜，僅測定某種單一的成分并不能全面的反映制劑的質量，利用HPLC指紋圖譜技術，可以最大程度地顯示復方的內在特性，實現全面控制產品質量的目的。

經過反復試驗研究，對魚腥草芩藍口服液指紋圖譜的分析條件進行逐級優化，確定樣品的處理方法，并建立了不同批次魚腥草芩藍口服液的指紋圖譜，且經方法學驗證證明指紋圖譜方法可行。

魚腥草芩藍口服液指紋圖譜的建立，可依據多個信息質量參數進行全方位的質量變動監控，直觀而全面的揭示魚腥草芩藍口服液的質量變化特征，為魚腥草芩藍口服液的質量控制提供了重要的方法。