玉屏風多糖對小鼠腸黏膜免疫應答和免疫損傷的調控作用

鄧 樺，楊 鴻，蔣焱平，陳 剛，王少杰，周兆海，梁浩釗，盧玉葵

(佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528231)

黏膜免疫系統是由呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道等黏膜相關淋巴組織共同構成的相對獨立的免疫體系，是機體免疫系統的重要組成部分。腸黏膜免疫系統具有特殊結構，直接參與和調控腸黏膜的免疫應答，并可由此介導共同黏膜免疫調節和全身免疫反應，具有重要的免疫功能[1-2]。中藥多糖可以明顯改善和增強腸黏膜免疫功能，保護和修復處于病變和應激狀態的腸黏膜免疫屏障[3-4]。玉屏風散由黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge)、白術(Atractylodesmacrocephala)和防風(Saposhnikoviadivaricata(Trucz.) Schischk.)組方而成，是提高機體免疫力的代表方劑。玉屏風多糖(Yupingfeng poly-saccharides，YPF-P)為其有效部位群，是該方劑臨床藥效的主要物質基礎。本項目組前期研究證實，玉屏風多糖對特異性和非特異性免疫功能均有顯著的增強作用[5-6]，但迄今鮮見其對腸黏膜免疫系統調控作用的研究報道。

腸黏膜免疫反應的誘導部位為腸上皮細胞(intestinal epithelial cell，IEC)和腸黏膜下集合淋巴結(Peyre's Patch，PP結)，PP結是誘導免疫應答的主要部位，腸上皮細胞除具有吸收各種抗原的功能外，還具有攝取和釋放分泌型IgA(Secretory IgA，SIgA)、提呈抗原、分泌細胞因子等多種功能。腸上皮細胞間淋巴細胞(intraepithelial lymphocytes，IELs)和黏膜固有層淋巴細胞(lamina propria lymphocytes，LPLs)則是腸黏膜免疫的主要效應部位[7]。

SIgA是腸黏膜免疫主要效應因子，是黏膜免疫應答的標志指標[8]。IL-2(interleukin-2，IL-2)是機體正常免疫功能的關鍵和免疫調節的中心，IL-6能夠刺激參與免疫反應的細胞增殖、分化并提高其功能。TGF-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可促進B細胞發生IgA類型轉換，促進SIgA的分泌，并可通過對IL-6基因轉錄的調節，促進IL-6的產生。升高IL-2等相關細胞因子可以保護腸黏膜免疫屏障，促進受損腸黏膜免疫屏障的恢復[9]。

試驗以黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)為對照藥物，以正常小鼠和免疫抑制小鼠為動物模型，通過研究口服多糖對腸黏膜誘導部位的激活、效應因子SIgA的分泌、腸黏膜效應部位的反應以及全身免疫應答的聯系，探討玉屏風多糖對小鼠腸黏膜免疫應答和免疫損傷的調控效應，為玉屏風多糖的臨床應用提供理論支撐與試驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 玉屏風散配方依據《中國藥典》，黃芪、白術和防風按照3∶1∶1質量配方。以L9(34)正交實驗優選提取工藝，水提醇沉法提取多糖，使用AB-8大孔樹脂純化精制，旋轉蒸發儀濃縮，真空冷凍干燥，高效液相色譜法鑒定。所得玉屏風多糖含量為90.75±2.3%，黃芪多糖的含量為90.68±5.1%。

環磷酰胺(Cyclophosphamide，CY)，德國Baxter Oncology GmbH，批號5H072A；Mouse SIgA ELISA Kit(武漢華美公司，批號 B10014455)；細胞因子試劑盒為ExCell Biology Inc.公司產品，Mouse/Rat TGF-β1 ELISA Kit(批號21G037)，Mouse IL-2 ELISA Kit(批號21F287)，Mouse IL-6 ELISA Kit(批號21F361)。

1.2 動物模型分組處理 150只SPF級NIH小鼠由廣東省動物實驗中心提供，實驗動物許可證號SCXK(粵)2013-0002。隨機分為5組，每組30只，雌雄各半。空白對照組(blank control，BC組)：灌服生理鹽水；CY免疫抑制對照(negative control，NC組)：生理鹽水+CY；YPF-P治療組(YPF-P treatment，T組)：YPF-P+CY；YPF-P對照組(positive control，PC組)：僅給藥YPF-P；黃芪多糖對照組(APS control，AC)：僅給藥黃芪多糖。多糖劑量均為200 mg/Kg/d，每天禁水禁食4 h后灌胃給藥，連續7 d；CY劑量為80 mg/Kg，隔日腹腔注射。給藥劑量和時間參照課題組前期試驗結果[5-6]。

1.3 IL-2、IL-6、TGF-β1和SIgA的檢測 小鼠摘眼球采血，分離血清，-20 ℃保存，用以檢測IL-2、IL-6、TGF-β1。取全段小腸，PBS沖洗，收集沖洗液，離心，取上清，-20 ℃保存，用以檢測SIgA。樣品均采用雙抗體夾心ELISA方法，按試劑盒說明書檢測。酶標儀450 nm波長測定吸光度(A)值，繪制標準曲線，根據標準曲線計算各指標濃度。

1.4 小腸及腸黏膜相關淋巴組織形態結構的觀察

分離十二指腸、空腸、回腸和PP結，取材，中性福爾馬林溶液固定，常規石蠟切片，蘇木素-伊紅(H.E)染色。采用病理圖像分析系統測量各組十二指腸、空腸、回腸的小腸形態結構特征與變化。每組各腸段選取6張切片，每張切片隨機選取10個視野，于放大倍數100×，測量小腸絨毛長度和隱窩深度，計算腸絨毛長度與隱窩深度的比值(length villus / intestinal crypt，V/C)，于放大倍數400×，計數各段小腸上皮內淋巴細胞和黏膜固有層淋巴細胞數量。

2 結果與分析

2.1 SIgA的變化 由圖1可知，PC組和AC組SIgA含量增加最為明顯，顯著高于其他各組(P<0.01)；NC組SIgA含量為所有組別中最低，顯著低于BC組(P<0.05)；T組與NC組相比，SIgA含量顯著增高(P<0.05)，回復正常水平。

2.2 TGF-β1的變化 由圖1可知，與BC組相比，PC組增高最為顯著(P<0.01)，AC組也有明顯增高(P<0.05)，NC組顯著降低(P<0.05)；與NC組比較，T組顯著增高(P<0.05)，回復正常水平。

2.3 IL-6的變化 由圖2可知，與BC組相比，除NC組呈上升趨勢外，其余各組IL-6水平均明顯升高(P<0.01)。

2.4 IL-2的變化 見圖2。PC組增高最為顯著，其次為AC組，與BC組相比均為P<0.01，NC組和T組則顯著降低(P<0.05)；T組與NC組比較，雖略有上升但未見統計學差異。

2.5 小腸黏膜相關淋巴組織的變化 結果見表1、表2和圖3。玉屏風多糖和黃芪多糖給藥后，PC組和AC組小鼠十二指腸、空腸和回腸腸壁增厚，腸絨毛長度、寬度和隱窩深度均顯著增加(P<0.05)；腸上皮細胞增生，杯狀細胞增多，中央乳糜管擴張，內有多量淋巴細胞；腸絨毛長度與隱窩深度的比值V/C升高(P<0.05或P<0.01)。隱窩內潘氏細胞(Paneth cell)體積增大，嗜酸性顆粒增多。腸上皮細胞間淋巴細胞IELs和黏膜固有層淋巴細胞LPLs數量明顯增多(P<0.05或P<0.01)。PP結顯著增生，體積增大，生發中心明顯。二者之間比較，玉屏風多糖對小腸黏膜相關淋巴組織的影響較黃芪多糖更為顯著。

NC組免疫抑制小鼠腸壁變薄，PP結明顯萎縮變小。腸絨毛長度、寬度和隱窩深度下降，V/C下降(P<0.05或P<0.01)，IELs和LPLs數量顯著減少(P<0.01)。T組上述各項指標均較NC組上升(P<0.05或P<0.01)。

同列數據右上標小寫字母不同者表示P<0.05，大寫字母不同者表示P<0.01，下同Different lowercases in the same column indicated P<0.05; different cap-ital letters in the same column indicated P<0.01，the same as follows

組別十二指腸/μm空腸/μm回腸/μm絨毛長度隱窩深度V/C絨毛長度隱窩深度V/C絨毛長度隱窩深度V/CBC361.1±33.3Aa67.8±3.2a5.2±0.6a325.4±33.2ADa72.1±5.8a4.5±1.3a218.2±21.5Aa68.7±9.2a3.2±0.4AaNC210.6±20.5B45.5±6.8b4.6±0.5b196.2±26.8B40.7±3.4b4.9±0.6a170.1±16.2B41.2±6.8b4.1±0.2AbT321.1±25.4Ab58.1±5.2c5.5±0.3a289.4±16.3DCb48.9±6.1b5.8±1.2a192.8±19.1B45.3±7.1b4.2±0.3AbPC402.5±17.2C63.6±7.0ac6.5±0.8c415.4±17.2Ab62.7±3.8a6.7±0.4b347.5±21.2C60.8±7.8a5.8±0.5CaAC413.7±32.6C65.8±9.2ac6.6±1.4c395.3±20.2Ab70.1±5.2a5.9±1.1a323.7±20.5C72.4±9.5a4.7±0.6ACb

表2 小鼠小腸IELs和LPLs的變化(n=6)Tab 1 Changes of IELs and LPLs in mice

A. AC組回腸；B. PC組回腸；C. PC組隱窩；D. PC組中央乳糜管；NC組空腸；F. T組空腸；G. NC組PP結；H. T組PP結A. AC group ileum；B. PC group ileum；C. PC group crypt；D. PC group central lacteal；E. NC group jejunum；F. T group jejunum；G. NC group Peyre's Patch；H. T group Peyre's Patch圖3 小鼠小腸黏膜相關淋巴組織的形態學變化(H.E，標尺100 μm)Fig 3 Histological changes of gut-associated lymphoid tissue in mice(H.E Staining, scale bar: 100 μm)

3 討論與結論

3.1 玉屏風多糖可增強小鼠腸黏膜SIgA的分泌，緩解環磷酰胺導致的SIgA含量下降 SIgA是腸黏膜免疫主要效應因子，是腸黏膜免疫的重要免疫屏障，因此提高SIgA含量對于維持腸黏膜免疫功能具有重要意義[8-9]。試驗結果表明，玉屏風多糖和黃芪多糖均可通過提升SIgA含量來增強正常小鼠的腸黏膜免疫功能，具有明顯的免疫促進作用。免疫抑制劑環磷酰胺可導致小鼠腸SIgA含量顯著減少，降低腸黏膜免疫功能，玉屏風多糖有效拮抗環磷酰胺的這一作用，恢復并提高小鼠腸SIgA含量。

3.2 玉屏風多糖可影響細胞因子的分泌，調節Th1/Th2平衡漂移 正常機體中輔助性T淋巴細胞亞群Th1/Th2 細胞處于平衡狀態，當機體發生免疫功能異常時，Th1/Th2發生漂移，平衡失調。Th1/Th2 的變化影響細胞因子網絡的平衡，與諸多疾病的發生、發展和轉歸關系密切[10]。

試驗結果發現，對于正常小鼠，玉屏風多糖作用后，Th1細胞因子IL-2、TGF-β1和Th2細胞因子IL-6水平均顯著上升，Th1/Th2 上調，在高水平上達到新的平衡，提示玉屏風多糖可明顯增強小鼠T、B淋巴細胞的活化增殖，促進SIgA的分泌。在免疫抑制小鼠，IL-2和TGF-β1顯著降低，而IL-6雖未出現顯著性變化，但呈現升高的趨勢，Th1/Th2向Th2漂移，免疫應答失調。結合文獻分析[11-12]，提示玉屏風多糖可通過上調IL-2和TGF-β1水平，調節Th1/Th2 漂移狀態，緩解環磷酰胺所致的免疫損傷。

3.3 玉屏風多糖可保護腸黏膜免疫屏障的完整性，增強腸黏膜免疫功能 腸上皮細胞、上皮細胞間淋巴細胞(IELs)、黏膜固有層淋巴細胞(LPLs)、腸黏膜下集合淋巴結(PP結)以及黏膜組織內各種單核淋巴細胞共同構成了完整的腸黏膜免疫屏障。腸上皮細胞參與SIgA的分泌，并有效轉運SIgA從黏膜固有層進入腸腔，還產生大量參與黏膜免疫調節的細胞因子，腸上皮細胞與杯狀上皮細胞分泌的黏液組成機體與外界的第一道屏障。PP結是腸黏膜免疫應答的誘導和活化部位；IELs被激活后可釋放IL-2和干擾素-ɑ、γ等多種細胞因子，參與機體免疫監控和免疫防御；LPLs包括B、T淋巴細胞、漿細胞和巨噬細胞等，可分泌IgA和IgM[1,13]。

試驗結果證實，玉屏風多糖和黃芪多糖對腸黏膜免疫應答的誘導部位和效應部位作用明顯，小鼠腸上皮細胞增生，杯狀細胞增多，腸絨毛長度、寬度和隱窩深度均顯著增加，腸上皮細胞間淋巴細胞和黏膜固有層淋巴細胞數量明顯增多，PP結體積增大，淋巴細胞增生。與黃芪多糖比較，玉屏風多糖對腸黏膜免疫屏障各項指標的影響更為明顯。而免疫抑制小鼠腸黏膜免疫屏障的損傷，可被玉屏風多糖有效緩解和改善。

綜上所述，玉屏風多糖對腸黏膜誘導部位(IEC和PP結)的激活、效應因子SIgA的分泌、腸黏膜效應部位(IELs和LPLs)的反應以及全身免疫應答(血清IL-2、IL-6和TGF-β1)影響明顯，可從多方面調控小鼠腸黏膜的免疫應答，增強腸黏膜免疫功能，并可有效緩解和改善免疫抑制小鼠腸黏膜免疫屏障的損傷。