青花菜乙烯反應傳感蛋白基因BoERS的克隆與表達分析

蔣 明 張志仙 張慧娟 管 銘 陳孝賞 尹龍飛 劉 潔

(1臺州學院生命科學學院，浙江椒江 318000；2臺州市農業科學研究院，浙江臨海 317000)

植物在與病原微生物協同進化(co-evolution)過程中形成了獨特的防御機制，當受到病原物入侵時，植物激活一系列防衛反應，引起基因表達和生理生化的改變，以抵御病原菌的進一步侵染和擴張[1]。在植物抗病反應中，水楊酸(salicylic acid，SA)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)和乙烯(ethylene，ET)等激素在復雜的信號轉導網絡中起著十分重要的作用，并能針對不同的病原菌對信號分子進行精確調控，以減少或消除病原物侵染對植物造成的傷害[2-5]。SA依賴的抗病信號途徑由活體營養型病原菌(biotrophic pathogens)觸發，如霜霉菌 (Hyaloperonospora parasitica)、蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae)、十字花科白粉菌(Erysiphe cruciferarum)等[6-8]。另一種抗病信號途徑則由JA/ET介導，主要針對死體營養病原菌(necrotrophic pathogens)的侵染，這些病原菌包括核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)等[9-10]。此外，JA/ET還介導非病原菌引發的誘導性系統抗性(induced systemic resistance，ISR)，如熒光假單胞菌WCS417r菌株可誘導產生ISR，以抵御丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringaepv.tomato)的侵害[11-15]。

乙烯介導的抗病信號傳遞途徑中，位于內質網膜上的乙烯受體起著感受和結合乙烯的作用[16]。乙烯受體在植物中以小家族形式存在，在擬南芥中共有5個成員，分別是 ETR1(ethylene resistant/ethylene receptor 1)、ETR2、ERS1(ethylene response sensor 1)、ERS2 和 EIN4(ethylene insensitive 4)[16-19]；番茄(Lycopersicon esculentum)中至少有6個成員，分別為LeERT1、LeERT2、NR、LeERT4、LeERT5、LeERT6[20-21]。組成型三重反應(constitutive triple response 1，CTR1)是乙烯信號轉導途徑的重要組分，乙烯受體與乙烯結合導致下游組分CTR1失活，并誘發后續的一系列信號轉導[22-23]。

青花菜(Brassica oleraceavar.italica)為十字花科蕓薹屬一年或二年生草本植物，是我國一種重要的蔬菜作物[24-25]。目前有關ERS的報道僅見于擬南芥(Arabidopsis thaliana)、石斛屬(Dendrobium)、萬代蘭屬(Vanda)和綠竹(Bambusa oldhamii)等少數植物[26-29]，ERS在青花菜中的研究尚未見報道。近年來，隨著青花菜種植面積的不斷擴大，菌核病、根腫病等病害的發生日趨嚴重，但由于青花菜種質資源的匱乏，限制了抗病種質的創制，而尋找優質的靶標基因用于分子育種，是解決這一難題的重要途徑之一[30-31]。本研究以青花菜為材料，在克隆BoERS的基礎上，研究核盤菌和根腫菌侵染下的表達模式，以期為BoERS基因的功能鑒定和青花菜分子育種奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

將青花菜材料Bo0112種植于人工氣候箱中(16 h光照/8 h黑暗)，培養至兩葉一心期時接種核盤菌和根腫菌，并采集健康葉片用于DNA的提取。核盤菌的菌核收集于浙江臨海上盤青花菜基地，菌核先用無菌水沖洗，在超凈工作臺上用0.1%HgCl2浸泡8 min，無菌水沖洗5次，然后用無菌濾紙吸干后，利用潔凈的手術刀片將菌核切成小塊，接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)上，再置于 22℃條件下恒溫培養，待菌絲長滿整個培養基表面時，用5 mm打孔器切取菌落邊緣的瓊脂塊，接種至葉片正面，對照接種 PDA 培養基。 分別采集處理 0、6、12、24、36、72 h時的葉片，液氮速凍后置于-80℃保存備用。根腫菌采自浙江溫嶺青花菜栽培基地，根部腫塊用自來水沖洗干凈后，無菌水浸泡30 min。根腫塊用無菌濾紙吸干后在研缽中研碎，再用多層紗布過濾，最后用無菌水稀釋成3×108cfu·mL-1的菌液。接種處理參照張小麗等[31]的方法，對照用等量的無菌水，分別于接種0、5、10、15、20、25 d 時采集病根，無菌水快速洗凈后用于RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 DNA、RNA的提取及cDNA的合成 稱取0.5 g葉片，液氮研磨成粉末后，用DNA快速提取試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)法提取基因組DNA，按照說明書進行操作；RNA的提取采用TRIzol法[32]，分別以對照、病原菌處理的葉片和根為材料，cDNA第一鏈的合成采用TaKaRa(日本)公司提供的PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，反轉錄的操作根據說明書進行操作。

1.2.2 基因的克隆 根據NCBI數據庫甘藍型油菜的ERS基因(登錄號:XM_013864976.1)，利用Primer Primer 5.0設計PCR引物。上游引物為5′-ATGTTAA ACACATTGTTAGTTCACGGTCT-3′，下游引物為 5′-TTA CTGACGCCAATGACCGTTAC-3′。 PCR 采用 25 μL 的反應體系，分別以葉片DNA和cDNA為模板進行擴增。 在 PCR 管中依次加入2.5 μL 10×緩沖液、0.5 μL 2 U·μL-1的Taq聚合酶、0.5 μL 10 mmol·L-1的 dNTP mix(上海生工生物工程股份有限公司)、20 μmol·L-1上/下游引物各 0.4 μL、35 ng模板，最后加無菌ddH2O至終體積25 μL。PCR反應程序:94℃預變性5 min；94℃ 變性 40 s，56.6℃ 退火 65 s，72℃ 延伸 2.5 min；72℃延伸 10 min，4℃保存。

PCR產物經電泳后，切割含目的條帶的膠塊，利用江蘇碧云天生物技術研究所提供的DNA凝膠回收試劑盒回收。連接體系為10 μL，包括5 μL快速連接緩沖液(2 ×)、1 μL pGEM-T easy 載體(Promega，USA)、3 μL回收產物和1 μL連接酶。 將反應物置于4℃冰箱中連接過夜，42℃水浴熱激90 s，然后將連接產物轉入DH5α大腸桿菌感受態細胞(北京全式金生物技術有限公司)。經平板涂布、37℃培養、藍白斑篩選、挑單菌落和PCR檢測，各挑選4份陽性菌液進行測序。

1.2.3 表達分析 根據測序結果設計實時熒光定量PCR引物，上/下游引物分別為5′-ATGTCCCATTTGCT CTCCGGC-3′和 5′-GTCTTCTTACTCAGCATAAACTCA CG-3′；以肌動蛋白基因為內標，上/下游引物分別為5′-TCTCGATGGAAGAGCTGGTT-3′和 5′-GATCCTTAC CGAGGGAGGTT-3′。 PCR 反應在 Roche LightCycler?96實時熒光定量PCR儀(Roche，Switzerland)上進行，在 20 μL 反應體系中，分別加入10 μL 2 × Master Mix、上/下游引物(20 μmol·L-1)各 0.25 μL、1 μL cDNA 和8.5 μL ddH2O。 PCR 程序:95℃ 預變性 10 min；95℃變性 15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40 個循環，設3次生物學重復，基因相對表達量(倍數)采用2-△△Ct法[33]計算。

1.2.4 生物信息學分析 BoERS的同源蛋白序列下載自NCBI，這些序列來自甘藍型油菜(CDX86641.1)、白菜(Brassica rapa)(XP_009111113.1)、蘿卜(Raphanus sativus)(XP_018447750.1)、鹽芥(Eutrema salsugineum)(ESQ36494.1)、薺菜(Capsella rubella)(EOA39884.1)、玉山筷子芥(Arabis lyratasubsp.lyrata)(EFH68467.1)、擬南芥(ANM61043.1)和亞麻薺(Camelina sativa)(XP_010457474.1)等作物。

在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)用于預測分子量、等電點、原子組成和總平均親水性系數(grand averageof hydropathicity，GRAVY)；DNAMAN 5.2.2軟件用于蛋白質的翻譯；SMART在線工具(http://smart.embl-heidelberg.de)用于預測編碼蛋白的結構域；Clustal X 1.81軟件用于對齊BoERS及同源蛋白序列分析。采用Mega 3.1構建系統發育樹，方法為鄰接法(Neighbor-Joining)，自舉檢測次數為1 000。

2 結果與分析

2.1 BoERS基因的序列分析

測序結果表明，BoERS的基因組 DNA全長為1 928 bp，在1 684～1 750 bp處有一個長度為68 bp的內含子，內含子符合GT-AG規則；編碼區全長為1 860 bp，編碼619個氨基酸(圖1)。

利用NCBI數據庫進行BLAST比對，發現BoERS與甘藍型油菜ERS(XM_009112865.2)序列的相似性最高，達99%，僅在8個堿基上存在差異；與白菜ERS(XM_009112865.2)的差異相對較大，相似性為95%；與蘿卜ERS(XM_018592248.1)的相似性較低，僅89%。

經在線工具ProtParam預測，BoERS的理論等電點為8.12，分子量為 68.2 kDa，分子式為 C3030H4878N824O889S35，GRAVY值為0.135，是一種疏水蛋白。利用SMART在線工具預測編碼蛋白的結構域，結果表明，BoERS共有6個結構域，分別位于序列的6～23、53～75、82～104、124～146、189～350和376～443處，其中 4個為跨膜結構域，另外2個分別為GAF結構域與HisKA結構域(圖2)。

圖1 青花菜BoERS的編碼區及推導的氨基酸序列Fig.1 Coding sequence and the deduced amino acid sequence of BoERS from broccoli

2.2 BoERS及同源蛋白的多重比對

利用Clustal X軟件對蛋白質序列進行多重比對，結果表明，BoERS與同源蛋白的相似性為77%～97%，與甘藍型油菜(CDX86641.1)的相似性最高，與白菜(XP_009111113.1)次之，相似性為95%，與蘿卜(XP_018447750.1)的相似性相對較低，為91%，與擬南芥(ANM61043.1)同源蛋白的相似性最低，僅為77%。TM2和TM4序列完全一致，TM3中僅3個位點存在差異，分別處于＋2、＋18和＋22位，但TM1之間的差異相對較大，除觀察到氨基酸的變異外，還存在插入/缺失現象(圖3)。GAF結構域中，中部序列的變異相對較大，出現大量的氨基酸變異和插入/缺失現象，而兩側的序列比較保守。與BoERS相比，白菜GAF上有4個氨基酸(SGGP)的插入，而在蘿卜GAF中，有5個氨基酸殘基(PGGGP)的缺失和5個氨基酸(PSSSR)的插入現象(圖4)。

2.3 系統發育分析

圖2 BoERS的結構域Fig.2 Domains of BoERS

利用MEGA軟件構建BoERS及其同源蛋白的系統發育樹，發現9種植物ERS序列的平均遺傳距離為0.137，其中蘿卜與薺菜 ERS之間的遺傳距離最大，為0.197，甘藍型油菜和青花菜的ERS之間最小，為0.009。BoERS與其他8種十字花科植物ERS之間的遺傳距離為0.009～0.1900；其中與擬南芥ERS的遺傳距離最大，為 0.190，其次為玉山筷子芥，為0.186；與甘藍型油菜 ERS的遺傳距離最小，僅為0.009。9種植物的ERS在系統發育樹上可分為5組，薺菜和亞麻薺ERS聚為一組(Ⅰ)，支持率為99%，玉山筷子芥與擬南芥 ERS聚為一組(Ⅱ)，支持率達100%，而鹽芥 ERS與它們的關系稍遠，單獨成組(Ⅲ)，青花菜BoERS與白菜、甘藍型油菜ERS聚為一組(Ⅴ)，支持率為100%；蘿卜ERS則單獨成組(Ⅳ)。

圖3 BoERS及同源序列的跨膜結構域Fig.3 Transmembrane domains of BoERS and its homologous sequences

圖4 BoERS及同源序列的GAF結構域Fig.4 The GAF domains of BoERS and its homologous sequences

圖5 BoERS及同源序列的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of BoERS and its homologous sequences

2.4 基因表達分析

根據測序結果設計實時熒光定量PCR引物，以肌動蛋白基因為參照。由圖6可知，BoERS的表達受核盤菌的誘導，與0 h相比，接菌6 h和12 h時的相對表達量無顯著差異；但在接種24～72 h時，相對表達量顯著增加，為CK的2.17～3.54倍，36 h時的相對表達量最大，24 h次之，為對照的2.25倍。BoERS的表達不受根腫菌的誘導，接種5～25 d時的表達量與CK相比均無顯著差異。

圖6 BoERS在2種病原菌侵染下的表達Fig.6 Expression of BoERS gene after inoculated by two pathogens

3 討論

在模式植物擬南芥中，乙烯信號轉導途徑為C2H4→乙烯受體(ERS1、ETR1、ETR2、EIN4 和 ERS2)→CTR1→EIN2→EIN3→ERF→乙烯反應，其中的EIN2(ethylene insensitive 2)是乙烯反應的正調控因子，它可被位于其上游的CTR1磷酸化，導致EIN2駐留在內質網上，乙烯信號傳遞終止；在乙烯濃度較高的情況下，乙烯與乙烯受體結合，造成CTR1無法被受體激活，后續的信號傳遞得以順利進行，從而引發乙烯反應[34-35]。近年來，已從多種植物中分離或鑒定到乙烯受體基因，但有關ERS的研究并不常見。研究表明，擬南芥ERS基因的編碼區全長為1 938 bp，編碼645個氨基酸；石斛品種‘Pompadour’的ERS編碼區長度為1 869 bp，編碼622個氨基酸[27]；綠竹ERS基因的編碼區全長為1 899 bp，編碼632個氨基酸[29]。綠豆(Vigna radiata)ERS基因的編碼區全長為1 911 bp，編碼636個氨基酸[36]。本研究中，BoERS的編碼區全長1 860 bp，編碼619個氨基酸，編碼區全長短于上述植物的ERS基因。BoERS具有1個內含子，數量與擬南芥ERS基因相同，但與水稻ERS不同，水稻ERS基因具有4個內含子[37]；BoERS的內含子較短，長度僅68 bp，與擬南芥ERS基因的內含子長度接近(72 bp)。ERS序列在十字花科植物中十分保守，暗示它們具有相似的功能。

研究表明，擬南芥的ERS有4個跨膜結構域、1個GAF結構域和1個HisKA[38]，與乙烯受體 ETR2和EIN4相比，ERS受體缺失接收結構域(receiver domain)，該區域可能參與乙烯的修飾[39]。本研究中，BoERS的跨膜結構域、GAF結構域和HisKA結構域的數量與擬南芥ERS一致。此外，BoERS的羧基端沒有接收結構域，符合ERS蛋白的特征。Lokkamlue等[28]對蘭科植物石斛屬(Dendrobium)、文心蘭屬(Oncidium)、小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsis equestris)和萬代蘭屬(Vanda)植物ERS的序列結果表明，位于N端的跨膜結構域十分保守，僅個別氨基酸殘基存在差別，而GAF結構域中部的變異較大，兩端則十分保守。本研究中，9種十字花科植物GAF結構域的保守性與4種蘭科植物相似，即中間多變兩端保守，但第一個跨膜結構并不像蘭科植物那樣保守，序列中存在大量的變異、插入/缺失現象。

乙烯是一種氣態的植物激素，在響應生物或非生物脅迫中起著重要作用，如干旱、冷害、高溫和某些病原菌等，乙烯傳感蛋白ERS在這些生物和非生物脅迫起著重要作用，其編碼基因的表達受諸多因素(如鹽、低溫、干旱)的誘導[40]。擬南芥ERS在葉片中的表達量較小，但經5 μL·L-1乙烯處理12 h后，ERS基因的表達量急劇上升，而ERS突變體對乙烯不敏感[41]。番茄乙烯受體基因LeETR4的表達受番茄瘡痂病菌(Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)的誘導，而反義植株對該菌的敏感性增加[20]。直根酸模(Rumex thyrsiflorus)ERS的表達受低氧環境的誘導，在O2濃度為3%時，RtERS的表達量顯著增加[42]。水稻(Oryza sativa)ERS基因OsERS的表達受乙烯誘導，但表達量較低[37]。低溫處理鱷梨(Persea americana)和西洋梨(Pyrus communis)果實的ERS基因表達量均顯著增加[43-44]。本研究中，BoERS的表達受核盤菌的誘導，表達量在接種36 h時達最大值，但該基因的表達不受根腫菌的影響，與比照相比，表達量無顯著差異。核盤菌為死體營養病原菌，其抗病信號途徑受JA/ET介導，植物與核盤菌相互作用，細胞內乙烯合成增加，導致ERS基因的表達量增加，而根腫病菌為活體營養菌，其抗病反應采用SA途徑，在此過程中沒有乙烯的合成，因此青花菜在根腫菌侵染下，不影響乙烯反應[45-46]。

4 結論

本研究以青花菜為材料，克隆到一個乙烯反應傳感蛋白基因，命名為BoERS。BoERS具1個內含子，編碼區全長為1 860 bp，編碼619個氨基酸，該編碼蛋白具有4個跨膜結構域、1個GAF結構域和1個HisKA結構域。序列比對結果表明，BoERS與蕓薹屬ERS序列的差異最小，與蘿卜屬、鹽芥屬等植物的ERS差異較大。實時熒光定量PCR結果表明，BoERS的表達受核盤菌的誘導，但不受根腫菌誘導。本研究為進一步開展BoERS基因的功能鑒定和應用研究奠定了基礎。下一步將分別構建RNAi和過量表達載體，研究該基因在抗病反應中的功能。