菜用豌豆品種資源萌發期耐旱性鑒定

趙愉風 周清元 郜歡歡 葉 桑 王 倩 程 闖 郭彥軍 崔 翠

(西南大學農學與生物科技學院，重慶 400715)

豌豆(Pisum sativum)為豆科(Leguminosae)豌豆屬(Pisum)一年生藤本作物，是世界上第四大食用豆類作物[1]。我國干豌豆栽培面積和總產量分別占全世界的 15.2%和 13.8%，青豌豆分別占全世界的23.1%和30.4%，在世界豌豆生產中占有十分重要的地位[2]。史料記載豌豆起源于西亞和地中海沿岸，我國豌豆的栽培歷史可追溯到2000多年前[3]。豌豆各部位包括豌豆苗、豌豆尖、豌豆莢、青豌豆、干豌豆，從發芽到生長，從開花到成熟，均可食用，且豌豆營養價值豐富、用途廣泛、適應性強，可用作主要旱區輪作倒茬作物；此外，豌豆種植過程中能進行生物固氮，提高土壤肥力，也是良好的綠肥作物[4]。然而豌豆生長過程中易受到干旱脅迫的影響，表現為植株高度降低，鮮重、干重、葉面積、葉片數下降，根系生長受到抑制等[4-5]。我國52.5%的豌豆生產區為山區或干旱、半干旱地區[6]，水資源短缺嚴重影響了豌豆的產量和品質[7]。因此篩選適宜的抗(耐)旱豌豆種質資源對豌豆栽培生產具有重要意義。

種子萌發是作物生活史的重要部分，該階段與幼苗成活率、營養器官生長及籽實產量密切相關[8]。種子萌發始于靜止的干燥種子吸收水分，待胚根突破種皮，種子即萌發完成[9]。種子發芽受到水分、溫度、光照等環境因素影響[10]，若豌豆種子萌發過程中出現水資源短缺會導致萌發時間延長，出苗率降低，使幼苗瘦弱，生長后期嚴重缺水甚至會導致幼苗體內物質代謝紊亂，生長緩慢甚至死亡，嚴重影響豌豆苗、豌豆尖、豌豆莢及青豌豆的產量和品質[10]。前人研究主要集中在干旱脅迫對豌豆的農藝性狀指標和生理生態響應方面[9-13]，對豌豆種子萌發期耐干旱種質資源的篩選報道并不常見。

本試驗對不同主產區收集到的菜用豌豆品種資源進行種子萌發期的耐旱性研究，利用PEG-6000模擬干旱環境，調查種子在萌發期部分性狀并根據綜合抗旱系數值(CDC值)、耐旱性度量值(D值)、加權關聯度(WDC值)大小對供試種質進行排序，通過相關性分析、主成分分析、聚類分析、灰色關聯度分析和逐步回歸分析等方法相結合對其耐旱能力進行綜合評價，研究豌豆種質在萌發過程中的室內耐旱性鑒定方法和主要參考指標，以期篩選出耐旱性強的品種(系)，為耐旱性品種(系)選育和生產中品種優化布局提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇不同豌豆生產區域主要種植的31份豌豆品種(系)為試驗材料(表1)，由西南大學農學與生物科技學院提供，于2017年3-5月進行發芽試驗。

表1 參試品種(系)Table1 Tested varieties(line)

1.2 適宜PEG濃度的篩選及試驗設計

選取遺傳背景不同的3份豌豆種子材料16158、16141、16106，分別用 0(CK)、1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%6個不同梯度濃度(w/w)的PEG-6000溶液進行處理。每品種選取360粒大小一致的種子，分別用75%乙醇溶液消毒1～2 min，清水沖洗干凈后，將種子置于培養皿中(每皿20粒)，并加入適量清水置于25℃RXZ智能型人工氣候箱(寧波江南儀器廠)進行24 h吸脹作用，取出后將種子重新擺放在鋪有雙層濾紙并分別加入20 mL不同濃度PEG-6000溶液的培養皿中進行干旱脅迫處理，每處理設3次重復，對照組則加蒸餾水代替PEG溶液。培養皿放在光照培養箱中進行發芽試驗，溫度為25℃，光周期為光照16 h/黑暗8 h，3 d后統計發芽勢，7 d后統計發芽率，根據種子萌發比例及萌發后生長情況篩選適宜的干旱脅迫處理濃度。

1.3 模擬干旱脅迫處理及其性狀調查分析

選用31份豌豆種質(表1)，按照濃度篩選時的方法和培養條件，以1.2中篩選得到的PEG-6000濃度作為脅迫濃度，每處理設3次重復。處理60 h后計算種子吸水率(seed water absorption ratio，WAR)；每天調查種子發芽數、3 d后統計發芽勢，7 d后統計發芽率，并每皿選取10顆籽粒測量其鮮重(fresh weight)、干重(dry weight)、根長(root length，RL)、芽長(buds length，BL)等性狀，計算發芽勢(germination energy，GE)、發芽率(germination rate，GR)、發芽指數(germination index，GI)、根冠比(root/shoot ratio，RSR)、活力指數(vitality index，Ⅵ)及物質貯藏轉運率(storage material transfer rate，STR)等指標。計算方法如下:

式中，Gt為第t天的發芽數，Dt為相應時間的發芽天數。

1.4 評價方法及數據統計分析

參考閆峰等[14]、羅俊杰等[15-16]、王蘭芬等[17]、汪燦等[18-20]的方法，以豌豆各品種10個指標的測量值作為基礎數據，對各性狀測量值求平均后進行差異顯著性分析，按照公式(7)、(8)分別計算單項耐旱系數(drought tolerance coefficient，DC)和綜合抗旱系數(comprehensive drought tolerance coefficient，CDC):

式中，Xij、CKij分別代表第i個指標第j個品種的干旱脅迫處理和CK測定值。

按公式(9)、(10)分別計算因子權重系數(ωi)和各指標的隸屬函數值[u(Xij)]:

式中，Pi代表第i個指標的綜合貢獻率；Xijmin、Xijmax分別代表第i個指標下第j個品種的DC值的最小值和最大值。

按公式(11)計算耐旱性度量值(drought tolerance evaluation value，D):

式中，U(Xi)為各主成分得分值；k為主成分分析中綜合因子個數。

按公式(12)、(13)計算關聯系數(ξi)和等權關聯度(γi):

式中，Δij代表品種最優性狀與第i個指標第j個品種(系)的的絕對差值；minΔij和maxΔij分別代表最小二級絕對差值和最大二級絕對差值；p為分辨系數(p=0.5)。

按公式(14)、(15)分別計算各指標權重系數[ωi(γ)]和加權關聯度(weight drought tolerance coefficient，WDC):

以DC值為比較序列，分別以D值和WDC值為參考序列進行灰色關聯度分析，獲得各指標DC值與D值之間的關聯度(γD)及DC值與WDC值之間的關聯度(γWDC)。

根據供試豌豆各品種(系)的D值，以加權配對算術平均法和歐氏距離進行聚類分析，并劃分出各品種的耐旱等級，分別對D值、CDC值和WDC值逐步回歸分析各指標DC值，獲得回歸方程。采用 Microsoft Excel 2010、IBM SPSS 19.0和SPSS 24.0統計軟件對數據進行整理和分析。

2 結果與分析

2.1 PEG-6000適宜濃度的篩選

由表2可知，3份豌豆品種(系)在不同PEG-6000濃度處理條件下，根長均受到不同程度的抑制。在0(CK)、1.0%、2.5%、5.0%、7.5%和 10.0%濃度下，3份豌豆品種(系)根長均值分別為4.38、3.63、2.92、2.52、2.00、1.74 cm，各處理組根長較 CK 分別下降 了 17.12%、33.33%、42.47%、54.33% 和60.27%。根長在2.5%PEG-6000處理下，與CK差異顯著，在1.0%～2.5%PEG間豌豆根長下降幅度最大。同時隨著PEG-6000濃度的增加，在5.0%時，16106根長受到嚴重抑制。綜上，將2.5%PEG-6000作為菜用豌豆耐旱品種資源篩選的濃度。

表2 不同濃度的PEG-6000脅迫處理對豌豆萌發期根長的影響Table2 Effects of different concentrations of PEG-6000 stress on root length during pea germination stage /cm

2.2 豌豆萌發期指標分析

由表3可知，CK和PEG-6000處理31個品種間差異均達到極顯著水平；各性狀變異系數分別介于19.30%～95.27%和20.34%～99.63%，其中芽長變異系數最大(95.27%和99.63%)，總鮮重變異系數最小(19.30%和20.34%)，按變異系數從大到小排序，CK豌豆各性狀依次為芽長＞活力指數＞物質儲藏轉運率＞根冠比＞根長＞發芽勢＞發芽指數＞發芽率＞種子吸水率＞總鮮重，PEG處理各性狀依次為芽長＞根冠比＞活力指數＞物質儲藏轉運率＞根長＞發芽勢＞發芽指數＞發芽率＞種子吸水率＞總鮮重。綜上表明，31份豌豆材料在種子萌發過程中各相關性狀均存在者廣泛的遺傳基礎，在其中進行耐旱性篩選是有效的。

表3 豌豆種子萌發相關指標分析Table3 Analysis on indexes related to pea seed germination

2.3 單項指標分析

分別對各性狀的耐旱系數(DC)進行分析(表4)，結果顯示，各性狀指標的DC值變異系數介于5.62%～78.60%之間，其中芽長的變異系數最大，達到78.60%，種子吸水率和總鮮重變異系數較小，分別為5.62%和7.60%，說明PEG-6000脅迫處理后芽長受到的影響較大，而種子吸水率和貯藏物質轉運率變化較小；從各性狀DC值變異系數來看，芽長(78.60%)、根冠比(76.16%)、活力指數(61.15%)、貯藏物質轉運率(52.33%)和根長(40.02%)在品種間變異幅度較大，可以作為種子萌發期耐旱資源篩選指標。從芽長DC值來看，大于平均值的品種(系)有15個，其中16104、16078、16107、16110、16139 和 16040 6 個品種(系)的DC值均大于1，說明模擬干旱脅迫條件下，這些種質芽長并沒有受到影響，反而具有一定的促進作用；31份豌豆根冠比 DC值平均值為 1.55，其中16147、16023、16140、16055、16105 的 DC 值較大，均大于3.0；活力指數DC值總體均值為0.77，大于均值的豌豆種質有14份，按照其大小排名前5的分別為16110、16107、16079、16040 和 16078；按貯藏物質轉運率DC值大小排序，排名靠前的品種主要為16110、16107、16141和16040；按根長DC 值進行排序，16110、16141、16107、16146、16040 和 16170 排名靠前。 從各單項指標來看，不同材料在不同的單項指標中表現不同，通過單項指標對31份種質進行耐旱性篩選結果也不相同，因此僅通過單項指標對豌豆種質萌發期耐旱性篩選存在著局限性。

表4 豌豆種質各指標的耐旱系數(DC)Table4 Drought-tolerance coefficients of parameter during seeds germination for pea germplasms

由表5可知，豌豆各指標(除根冠比)都與其他至少一個指標呈顯著或極顯著相關，表明各指標之間具有一定程度的相關性。其中發芽勢與發芽率、發芽指數、活力指數、根長、芽長、物質貯藏轉運率呈極顯著正相關，相關系數介于0.554～0.921之間，相關程度較高；物質貯藏轉運率與總鮮重呈顯著相關，相關系數為0.387；總鮮重與活力指數、種子吸水率呈極顯著正相關，相關系數分別為0.570、0.579；種子吸水率與活力指數呈顯著正相關，相關系數是0.385，說明種子活力越強，其吸水保水能力越好，可進一步使鮮重增加。根冠比是由根長和芽長2個單一性狀組成的復合性狀，結果顯示根冠比與2個單一性狀之間并沒有顯著相關性，說明不同材料在受到脅迫時沒有表現出相同的變化趨勢。以上結果表明，干旱脅迫影響根的生長發育，從而影響豌豆種子發芽(發芽勢、發芽率、發芽指數)、活力指數、地上部生長(芽長)和物質貯藏轉運。

表5 豌豆種質各指標耐旱系數(DC)的相關性Table5 Correlations of drought-tolerance coefficients between parameters during germination of pea germplasms

參照連續變數的次數分布統計方法[21]，以組距為0.2將各性狀耐旱系數作次數分布表(表6)。結果表明同一區間內的各指標DC值分布次數和頻率相差較大。0.6＜DC≤1.2范圍內，各指標分布較集中，發芽指數、活力指數、發芽勢、發芽率、根長、貯藏物質轉運率、總鮮重、根冠比、種子吸水率和芽長的分布頻率分別為 74%、61%、74%、74%、68%、54%、100%、35%、100%、39%；1.2＜DC≤2.0時，發芽指數、活力指數、發芽勢、發芽率、根長、貯藏物質轉運率、根冠比、芽長的分布頻率分別為 9%、3%、9%、9%、12%、6%、24%、9%，說明這些指標對干旱脅迫的反應靈敏；DC＞2.0時根冠比的分布頻率為26%，表明干旱脅迫對多數品種的根冠比影響較大。各指標對干旱脅迫反應的敏感性從小到大依次為芽長、貯藏物質轉運率、活力指數、種子吸水率、根長、發芽率、發芽勢和發芽指數、根冠比、總鮮重。不同性狀對干旱脅迫的響應程度存在差異，同一品種(系)不同指標間耐旱系數也不完全一致。次數分布和單一指標(DC值分析)均表明，豌豆耐旱性種質資源篩選鑒定需要通過多個指標進行綜合評價，才有可能避免片面性。

2.4 萌發期主成分分析

參照唐啟義[22]數據處理系統進行主效因子分析，其中，因子個數的選取遵循兩條原則:一是累積貢獻率要占總貢獻率的80%以上；二是特征值要大于等于1。由表7可知，各因子特征值中前3個因子的貢獻率分別為52.423%、15.717%和13.344%，累計貢獻率達81.483%，其特征根 λ＞1.334。其中，主成分1(F1)在發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數和物質貯藏轉運率有較高載荷量，載荷量分別為0.888、0.896、0.913、0.948、0.888，這5個指標反映了豌豆種子萌發期的萌發狀況。主成分2(F2)在根冠比和種子吸水率上載荷量較大，分別為0.656、0.641，這2個指標反映了豌豆的生長積累狀況。主成分3(F3)在總鮮重上載荷量最大，為0.783，其反映了豌豆的生長狀況。

2.5 菜用豌豆種質資源耐旱性綜合評價

由表8可知，供試種質綜合耐旱系數(CDC值)介于0.307～1.449之間，平均值為 0.909，標準差為0.248，變異系數為27.308%。根據CDC值大小對供試種質進行耐旱性排序，耐旱性最強的4個品種依次為16110、16055、16140、16107；耐旱性最弱的3 個品種依次為16106、16175、16177，其余種質介于兩者之間。耐旱性度量值(D值)介于2.359～11.147之間，平均值為6.603，標準差為1.779，變異系數為29.346%。根據D值大小對供試種質進行耐旱性排序，耐旱性最強的4 個品種依次為16110、16107、16055、16140，耐旱性最弱的3個品種依次為16106、16175、16177。WDC值大小為 0.307～1.441，平均值為 0.915，標準差為0.250，變異系數27.342%。基于加權關聯度(WDC值)大小進行耐旱性排序，結果顯示，耐旱性最強的4個品種依次為16110、16055、16140和16107；耐旱性最弱的3個品種依次為16106、16175和16177。D值、CDC值、WDC值對供試品種耐旱性評價結果基本吻

合，將3種排序順序相加，進行綜合排序，耐旱性最強的4 個品種依次為16110、16055、16107、16140，耐旱性最弱的3個品種依次為16106、16175和16177。

表6 供試豌豆種質各指標耐旱系數的頻次分布Table6 Different distributions of drought-tolerance coefficients of all indices in tested pea germplasms

表7 供試豌豆種質各指標主成分的特征向量及貢獻率Table7 Eigenvectors and contribution rates of principal components of all indices in tested pea germplasms

表8 供試豌豆品種(系)耐旱性評價的DC值、WDC值、D值的綜合排序Table8 Comprehensive ranking of DC value，WDC value and D value of drought tolerance evaluation in tested pea germplasms

2.6 灰色關聯度分析

由表9可知，在干旱脅迫下，等權關聯度(γD)反映各指標DC值與D值的密切程度，其值介于0.502 2～0.551 6之間，從大到小依次為根冠比、種子吸水率、總鮮重、發芽率、發芽指數、發芽勢、根長、活力指數、物質貯藏轉運率和芽長。灰色加權關聯度(γWDC)反映各指標DC值與WDC值的密切程度，其值介于0.7324～0.937 5之間，從大到小依次為發芽指數、發芽率、發芽勢、總鮮重、種子吸水率、根長、活力指數、貯藏物質轉運率、芽長和根冠比。

表9 供試豌豆種質各指標DC值與D值和WDC值的關聯度及各指標權重Table9 Correlation degree between DC value of all indices and D value together with WDC value and indices weight in tested pea germplasms

2.7 聚類分析及耐旱級別的劃分

以加權配對算術平均法進行聚類分析，在歐氏距離D2=8.5處，可以將31份供試豌豆品種(系)分為4類群(圖1)。第Ⅰ類群包含16054、16142等 20份材料，占總數64.52%；第Ⅱ類群為包含16140、16079和16055共3份材料，占總數的9.68%；第Ⅲ類群包含16175、16177、16106、16096、16051 和 16104 共 6 份材料，占總數的19.35%；第Ⅳ類包含16110和16107共2份材料。統計4個類群各耐性評價單項指標、D值、CDC值和WDC值(表10)，結果表明，第Ⅰ類材料除芽長外其他各指標數據在4個類群中最低，說明第Ⅰ類群萌發期對干旱脅迫極敏感；第Ⅱ類群的D值、CDC值、WDC值高于第Ⅲ類群和第Ⅰ類群，可以歸類為較耐旱材料；第Ⅳ類群2份材料除根冠比外其余9個單項指標和3個綜合指標均最大，因此可以將該類群歸類為耐旱性強材料。綜上，4個類群耐旱性從強到弱依次為第Ⅳ類群＞第Ⅱ類群＞第Ⅲ類群＞第Ⅰ類群。

2.8 逐步回歸分析

圖1 基于D值的供試豌豆種質資源(抗)耐旱性聚類圖Fig.1 Cluster map of drought tolerance of pea germplasm based on D value

表11 供試豌豆種質抗旱性模型預測Table11 Prediction of drought resistance model for tested pea germplasms

表10 供試豌豆種質抗性評價指標的分級Table10 Grading evaluation of index about drought resistance of pea germplasm

分別以D值、CDC值和WDC值為參考序列，對供試豌豆品種(系)各指標DC值進行逐步回歸分析，得出3個逐步回歸方程(表11)，通過F檢驗3個方程都達到極顯著水平，說明3個方程擬合度好，預測精度較高，可用這3個方程進行菜用豌豆品種萌發期抗(耐)旱性評價。此外，由逐步回歸方程可知，在豌豆種質資源萌發期抗(耐)旱性鑒定中，選擇性地將與D值密切相關的指標，如發芽指數、活力指數、發芽勢、根長進行測定，可有效鑒定豌豆種質資源的耐旱性，從而使鑒定工作簡化，提高工作效率。

3 討論

農作物抗逆性鑒定按照生育時期可分為萌發期鑒定、苗期鑒定和成株期鑒定[23]。萌發期是作物群體數量建成的關鍵時期，具有便于操作、周期短、效率高、易受環境影響等特點[24]。豌豆在種子播種后，干旱脅迫會導致其出苗率降低、出苗時間延長、生長發育受阻[25]。

目前，諸多研究者針對作物萌發期進行了抗(耐)旱性鑒定的研究，不同研究所采用的篩選鑒定指標都有所不同，最終篩選出來的耐旱性指標也存在差異。如陳學珍等[26]對20個大豆品種芽期耐旱性研究發現，在發芽勢和發芽率均高的情況下，二者可作為耐旱性鑒定的指標。劉學義等[27]在大豆成苗期根毛與耐旱性的關系研究中發現胚根的長短與耐旱性密切相關，耐旱品種的胚根比其他類型的品種長。王利彬等[28]在大豆種質資源芽期耐旱性鑒定中發現干旱脅迫下胚根和下胚軸的生長狀況可作為評價大豆芽期耐旱性的生理指標。陳新等[29]研究表明，植物抗(耐)旱性與萌發期種子活力指數具有一定的相關性，萌發期種子活力指數可以作為抗(耐)旱性鑒定的重要指標。Bewley[30]研究認為貯藏物質轉運率在一定程度上可能決定了幼苗生長狀況。本試驗最終篩選出發芽勢、發芽率、活力指數、活力指數、根長作為豌豆萌發期的優先耐旱性評價指標。

植物的耐旱性受遺傳因子和環境共同控制，采取單項指標進行耐旱性評價的有效性和準確性較低，因此，同時觀測多個指標，進行綜合分析后對試驗材料進行耐旱性評價很有必要[31]。本研究通過主成分分析法、隸屬函數法得到抗(耐)旱性度量值(D值)，其能夠綜合各指標間的相互關系且避免了單一指標存在的片面性，可較準確地評價豌豆的抗(耐)旱性[32]。灰色關聯度分析作為衡量因素間關聯程度的一種方法，顯示了各指標的重要性[33]。本研究以各指標DC值為比較序列，D值和WDC值為參考序列，結果顯示各指標分析在D值和WDC值間有較強的一致性，與朱宗河等[34]和謝小玉等[35]對油菜的研究結果一致。聚類分析是通過應用變量的數值特征變化從而對研究對象進行分類的統計方法，具有一定的可靠性[36]。本試驗以D值、CDC值和WDC值為依據進行各種(系)分類，在綜合耐旱評價的基礎上，將31份豌豆種質材料分為4類，這與薏苡[18-20]、胡麻[37]、小麥[38]等作物的耐旱性鑒定結果一致。本研究結果為今后菜用豌豆萌發期抗旱性鑒定提供了理論依據，也為耐旱豌豆品種的選育、優化布局與推廣應用提供了一定的理論參考。

4 結論

本研究結果表明，31份豌豆品種資源在未干旱處理下，種子萌發相關性狀指標變異系數介于19.30%～95.27%；而在模擬干旱處理下各指標變異系數介于20.34%～99.63%之間。各性狀在品種間均存在著顯著差異，表明31份豌豆材料具有廣泛的遺傳基礎。通過單項指標DC值分析，每個單項指標篩選出耐旱性種質不同，表明單項指標篩選具有一定的局限性；根據綜合抗旱系數值(CDC值)、耐旱性度量值(D值)、加權關聯度(WDC值)大小對供試種質進行排序，其中耐旱最強的4個品種依次為16110、16055、16140和16107；耐旱性最弱的3個品種依次為16106、16175和16177。聚類分析將31份豌豆品種資源劃分為4個類群。逐步回歸分析表明，與D值密切相關的指標為發芽指數、活力指數、發芽勢、根長，這些可作為豌豆種質資源萌發期耐旱性鑒定綜合選擇指標。本研究結果為菜用豌豆耐旱機理、干旱調控緩解機制、菜用豌豆耐旱品種培育及其推廣等研究奠定了一定的理論。