高壓脈沖電場對釀酒酵母發酵能力的影響

范成凱 應南嬌 樊 凱 徐 瑩 楊 勇

(杭州電子科技大學生命信息與儀器工程學院，浙江杭州 310018)

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是人類生產生活中最重要的微生物菌種之一，被廣泛應用于酒品釀造、食品烘焙及生物質乙醇等化合物的生產，在整個發酵過程中發揮著重要的催化作用[1-2]。為了滿足巨大的應用需求，人們嘗試采用各種方法來提高釀酒酵母的發酵能力，以縮短發酵時間，提高糖類物質轉化為乙醇等產物的效率，進而降低生產時間和成本、增加生產效益。近年來，各種新興的物理輔助技術應用于微生物發酵的潛能越來越受到人們關注。研究表明，靜態磁場對釀酒酵母的生長具有促進作用[3-4]，低功率超聲波也可以提高釀酒酵母發酵過程中乙醇的產出[5-6]。

高壓脈沖電場(pulsed electric field，PEF)作為一種非熱滅菌技術，因其處理效率高、能耗需求低及對環境無污染等良好的應用特性主要被用于液態食品滅菌領域[7-9]，有關PEF對微生物滅菌的機理機制也有諸多研究。隨著對PEF技術的深入了解，PEF的應用價值被進一步挖掘且不再局限于微生物滅菌領域。研究表明，PEF作用下植物細胞中花青素等次級代謝產物的合成增加[10-11]，Ohshima等[12]研究發現在電場強度為12 kV·cm-1的 PEF處理60 s后，大腸桿菌中的β-半乳糖苷酶的活性得到提高；Yin等[13]研究發現PEF可以提高厭氧氨氧化菌的活性并促進其生長，且與低強度超聲波和磁場相比，PEF表現出更高的處理效率。釀酒酵母的發酵建立在細胞內一系列的酶催化反應及良好的生長代謝的基礎上。前人研究表明，適當條件下的PEF可以提高酶的活性并促進細胞的生長，這為PEF作為一種更具優勢的方法應用于酵母發酵提供了可能性[13]。

目前，有關PEF對釀酒酵母生理行為影響的研究主要集中在食品加工領域中對酵母菌的滅活等方面，而PEF對釀酒酵母發酵能力的影響尚鮮見報道。為了尋求PEF技術應用于釀酒酵母發酵的可行性，本研究以電場強度為唯一變量，采用不同電場強度的PEF刺激釀酒酵母，通過檢測發酵底物中酵母生長量、葡萄糖消耗量和乙醇產出量等指標，并利用流式細胞術(flow cytometer，FCM)檢測釀酒酵母細胞生理狀態的變化，綜合分析PEF對釀酒酵母生理狀態和發酵能力的影響，以期為PEF技術應用于發酵工業提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 酵母菌懸浮液的制備

活性干酵母粉(版號HY1505)購自湖北宜昌安琪酵母公司；酵母液態培養基(yeast extract peptone dextrose medium，YPD):葡萄糖 20 g·L-1、蛋白胨 20 g·L-1、酵母提取物 10 g·L-1；YPD 瓊脂固體培養基另加 20 g·L-1瓊脂粉。

酵母活化:在100 mL濃度為4%的葡萄糖溶液中加入2 g活性干酵母粉，輕輕混勻后35℃靜置15 min，取適量劃線至YPD瓊脂培養基培養，得到單菌落后接種至YPD液體培養基，搖床培養(30℃，180 r·min-1)至對數生長期備用。

1.2 高壓脈沖電場預處理

高壓脈沖電場處理系統由杭州電子科技大學研制開發[14]。選定高壓脈沖電場脈寬5 μs，頻率100 Hz、作用時間100 s、極板間距(d)1 cm、樣品處理容量1 mL，輸出波形為方波。場強E的計算公式為E=U/d，通過改變電壓來改變電場強度。本試驗采用PEF電場強度為1、6 kV·cm-1對釀酒酵母進行預處理。

1.3 釀酒酵母熒光染色及流式分析

采用碘化丙啶(propidium iodide，PI)和羧基熒光素雙乙酸酯[5(6)-carboxyfluorescein diacetate，5(6)-cFDA]對釀酒細胞進行雙重染色，結合流式細胞術(FCM)檢測并表征酵母細胞內酯酶活性和酵母細胞生理狀態[15]。

釀酒酵母懸浮液經PEF處理后用PBS緩沖液(pH 值 7.2)清洗并離心(4 000 r·min-1，4℃，3 min)2次，然后用PBS緩沖液將酵母細胞重懸至濃度為105～106CFU·mL-1。取1 mL釀酒酵母菌懸液，加入10 μL 2 mg·mL-1PI染液，30℃避光孵育 10 min，然后加入 10 μL 5 mg·mL-15(6)-cFDA 染液，再次 30℃避光孵育10 min，染色完成后用PBS緩沖液清洗2次并重懸至1 mL。以相同體積不進行任何染色的酵母懸浮液作為陰性對照。采用 Accuri C6流式分析儀(美國BD公司)對酵母細胞進行分析，每個樣品收集約10 000個細胞。

1.4 酵母發酵培養

酵母發酵培養基:葡萄糖70 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1、硫酸銨 1 g·L-1、磷酸二氫銨 1 g·L-1、硫酸鎂1 g·L-1。PEF處理后的酵母懸浮液按5%接種量分別轉接至發酵培養基，30℃恒溫搖床(180 r·min-1)培養12 h，分別取發酵時間為4、8、12 h時的發酵底液，經離心后取上清液，于-80℃凍存備用。

1.5 釀酒酵母發酵活性的檢測

1.5.1 發酵底液中葡萄糖、酒精含量的測定 采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測定釀酒酵母發酵底液中的葡萄糖和酒精含量[16]。色譜分析條件:Shimadzu LC-10AD液相色譜儀(日本島津)，Shimadzu RID-10A示差檢測器(日本島津)，Shodex sugar KS-803配位交換色譜柱(日本Shodex)；流動相為 H2SO4-H2O 溶液(v/v，0.5 ∶1 000)，流速0.8 mL·min-1，進樣量0.5 mL，色譜柱柱溫為60℃。

1.5.2 發酵底液中釀酒酵母細胞生長量的測定 先取干燥離心管稱重，然后加入適量釀酒酵母發酵底液，4℃條件下10 000 r·min-1離心5 min，取沉淀用蒸餾水反復清洗并重復離心3次，棄去上清液后將裝有濕菌體的離心管置于65℃烘箱中干燥至恒重，減去離心管重量即得菌體干重。

1.6 數據分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 9.0統計軟件對試驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 PEF處理對釀酒酵母生長量的影響

經測定，發酵12 h后未經PEF處理的釀酒酵母干重為 0.460±0.05 g，電場強度為 1、6 kV·cm-1的 PEF試驗組釀酒酵母發酵底物中酵母干重分別為0.512±0.006、0.419±0.027 g。 結果表明，經在電場強度為1 kV·cm-1的PEF處理后釀酒酵母的生長得到提高，即1 kV·cm-1的PEF促進了釀酒酵母細胞的生長。

2.2 釀酒酵母細胞的流式分析

PI染料表征破損及死亡生理狀態下的酵母細胞，cFDA染料表征細胞內酯酶活性變化。LL區域表示細胞碎片或未得到PI和5(6)-cFDA染色的菌體，LR區域代表具有活性且細胞膜完整的酵母細胞，UR區域的細胞雖具有活性但是細胞膜受損，UL區域為已死亡細胞。PEF電場強度為1 kV·cm-1處理組中具有活性釀酒酵母細胞比例為89.8%，其中，具有細胞活性但細胞膜受損的比例為17.6%；6 kV·cm-1處理組中具有活性釀酒酵母細胞比例為89.9%，但細胞膜受損的活細胞比例為27.9%(圖1)。綜上，經電場強度為1、6 kV·cm-1的PEF處理后，具有內酯酶活性的釀酒酵母細胞比例均維持在較高水平，但PEF電場強度為6 kV·cm-1時，在具有活性的酵母細胞中細胞膜受損的比例大于1 kV·cm-1。

圖1 流式細胞儀分析染色釀酒酵母細胞結果Fig.1 Results of flow cytometry analysis of Saccharomyces cerevisiae

2.3 PEF處理對釀酒酵母發酵底物中葡萄糖及酒精含量的影響

葡萄糖是釀酒酵母生長代謝過程所需的重要營養物質之一。乙醇是釀酒酵母發酵的主要產物。發酵底液中葡萄糖和乙醇含量的變化可以作為檢測釀酒酵母發酵能力的重要指標。由圖2、圖3可知，發酵時間為0～8 h時，釀酒酵母的生長和發酵活動較為緩慢，發酵8 h后釀酒酵母發酵底物中的葡萄糖消耗的速度加快，同時乙醇產量也迅速增加，釀酒酵母的生長和代謝開始加速；發酵12 h時，與未經PEF處理組(電場強度0 kV·cm-1)相比，電場強度1 kV·cm-1處理組釀酒酵母發酵底物中葡萄糖消耗量提高了10.18%，乙醇產出量提高11.05%，而6 kV·cm-1處理組組釀酒酵母發酵底液中葡萄糖消耗量和酒精產出量分別下降5.13%和9.06%。綜上，電場強度1 kV·cm-1的 PEF處理可提高釀酒酵母的葡萄糖消耗量和酒精含量。

3 討論

高壓脈沖電場處理會導致細胞膜出現“電穿孔”[17-18]，提高細胞膜的通透[19-20]，進而促進細胞對離子、小分子物質的吸收[21]。細胞增加營養物質的攝取對其自身的生長及代謝具有重要意義。此外，高壓脈沖電場可以促進質粒DNA的轉運[22]、提高酵母細胞內過氧化氫酶的活性[23]。也有研究證實PEF處理后釀酒酵母細胞中谷胱甘肽合成酶相關的基因被誘導表達[24]；酶活性和相關基因表達量的增加也可能是釀酒酵母發酵能力提升的原因。高壓脈沖電場會對細胞膜造成一定的損傷，細胞膜受損的部分細胞在適當條件下可恢復其原有活性[25-27]，但當高壓脈沖電場強度足夠大時，細胞膜穿孔將進一步擴大，細胞蛋白質、DNA等大分子內容物外滲，甚至導致酵母細胞死亡[28-29]。因此，保證釀酒酵母的生存率是PEF提高釀酒酵母發酵能力的前提。

圖2 PEF處理對發酵底物中葡萄糖相對濃度的影響Fig.2 Effect of PEF treatment on relative glucose concentration of fermentation substrates

圖3 PEF處理對發酵底物中酒精含量的影響Fig.3 Effect of PEF treatment on ethanol concentration of fermentation substrates

本研究通過比較電場強度為1、6 kV·cm-1的PEF對釀酒酵母發酵能力的影響，發現適當條件下的PEF對釀酒酵母的發酵能力具有積極影響，可以加快酵母的生長繁殖，提高乙醇的產出效率。Mattar等[30]進行的PEF刺激釀酒酵母生長的研究結果與本研究結果一致。此外，Najim等[31]研究發現PEF處理后保加利亞乳桿菌表現出對其生存環境更高的耐酸性，后續PEF對釀酒酵母影響的研究也可從釀酒酵母的耐酒精性等外界環境耐受性的角度進行探究。綜合本研究中流式細胞術和發酵試驗結果分析發現，電場強度為1、6 kV·cm-1的PEF對釀酒酵母的細胞活性和發酵能力表現出不同的影響，經1 kV·cm-1PEF刺激后的酵母細胞表現出更高的生長速率和發酵能力；而6 kV·cm-1組酵母細胞的生長與代謝活動卻低于對照組(電場強度0 kV·cm-1)，且對釀酒酵母的損傷效應更為明顯。因此，選擇合適的電場參數對提高釀酒酵母發酵能力具有重要意義。在后續的研究中，可繼續深入探究不同電場參數與釀酒酵母發酵表現之間的關系，盡量減小PEF對酵母細胞造成的損傷，以達到提高釀酒酵母發酵能力的最佳效果。

4 結論

高壓脈沖電場處理可以促進釀酒酵母細胞的生長和相關代謝活動從而提高釀酒酵母的發酵能力，經電場強度為1 kV·cm-1的PEF處理后的釀酒酵母細胞，其菌體生長量、發酵底物中葡萄糖消耗量和酒精產出量均得到提升，表明選擇合適的高壓脈沖電場參數對釀酒酵母進行預處理，可以促進其發酵能力。本研究僅就PEF處理對釀酒酵母發酵能力的影響作了初步探討，今后可從釀酒酵母相關基因和蛋白質表達水平變化的角度，深入研究PEF處理提高釀酒酵母發酵能力的作用機制。