亞東黑耳的氨基酸特征分析及蛋白質品質評價

陳洪雨 鮑大鵬 楊瑞恒 王 瑩 高英女 李 燕 吳瑩瑩

(上海市農業科學院食用菌研究所/國家食用菌工程技術研究中心/農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，上海 201403)

亞東黑耳(Exidiasp.)為黑耳屬物種，是產自西藏亞東地區的珍稀大型食用真菌，曾一度被誤認為是黑木耳(Auricularia heimuer)[1-3]。亞東黑耳主要集中分布于西藏自治區日喀則市亞東縣的下亞東和下司馬鎮的林區灌木叢中，且僅專一性地寄生于峨眉薔薇的枯枝上[1]。目前，亞東黑耳僅能天然采收，尚未實現人工栽培，故鮮見有關亞東黑耳的研究報道。熊衛萍等[1]通過形態學和分子系統學明確了亞東黑耳為黑耳屬(ExidiaFr.)的一個種，與其遺傳距離最近的是短黑耳(Exidiarecisa)，且亞東黑耳與木耳屬(Auricularia)的黑木耳在聚類分析中分屬于2個不同的分支，親緣關系較遠。李兆坤等[2]研究了亞東黑耳菌絲的發酵條件，并對其菌絲的人工培養條件進行探索，發現初始pH值和溫度對次級代謝多樣性的影響較為明顯。

食用真菌是優質的膳食蛋白來源，常見市售食用菌蛋白質含量充足、必需氨基酸種類豐富，且品質優于許多果蔬和谷物[4-5]。蛋白質品質是膳食營養的重要評價指標[6-7]，其評價方法主要依據平衡模式譜[8-10]。早期世界衛生組織等機構依據雞蛋蛋白氨基酸組成和人體氮平衡發布的模式譜至今仍廣為使用[11-13]，且在臨床營養學數據的支持和推動下，國際營養學界已經推行了兩種新的氨基酸平衡模式譜。將人群適應性、蛋白質生物利用率、食物矩陣等因素納入考量范圍后，現行平衡模式譜主要包括世界衛生組織/糧農組織/聯合國大學(World Health Organization/Food and Agricultural Organization/United Nation University，WHO/FAO/UNU)聯合發布的模式譜和美國國家科學院醫學研究所(Institute of Medicine，IOM)提出的模式譜[8-10]。基于氨基酸模式譜確立的各參數模型是氨基酸營養特征分析和蛋白質品質評價的重要依據。

亞東黑耳作為一種稀有的野生食用菌資源，由于樣本不易取得，其營養價值尚無系統測評，氨基酸特征和蛋白質品質未見報道。本研究以采自西藏亞東地區的野生黑耳為樣品，首次引入了現行國際最新版氨基酸平衡模式譜，并結合常見模型對亞東黑耳的氨基酸特征和蛋白質營養進行了全面評價，以期為食用菌營養研究和黑耳產品開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞東黑耳樣品采自西藏自治區日喀則市下轄亞東縣的林區灌木叢，收集了5個采樣地點的薔薇枝條上的野生黑耳子實體，將500 g新鮮野生黑耳樣品晾曬制成干品后，充分混合后備用。黑木耳1為吉林省蛟河市黃松甸食用菌大市場購得的人工栽培黑木耳干品。黑木耳2為黑龍江省牡丹江市海林黑木耳基地提供的人工栽培黑木耳干品。

硼酸、濃硫酸(98%)、濃鹽酸(37%)、氫氧化鋰、氫氧化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、氯化鈉，均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。茚三酮和緩沖液為日本日立集團提供的氨基酸分析儀配套試劑。

1.2 主要儀器與設備

DT-100高速粉碎機，上海機械設備有限公司；DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精密實驗設備有限公司；835-50氨基酸自動分析儀，日本日立公司；Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理 將預混合好的黑耳樣品和不同木耳樣品分別用高速粉碎機粉碎并過20目篩，采用四分法[14]取樣待測。取樣后，將樣品置于70℃烘箱內干燥4 h并儲存于干燥器中備用。

1.3.2 樣品水分的測定 參照標準GB 5009.3-2016[15]的方法，采用直接干燥法在110℃烘箱中將樣品烘干至恒重后稱重。

1.3.3 樣品粗蛋白測定 參照標準GB5009.5-2016[16]，采用自動凱氏定氮儀測定樣品中的粗蛋白含量。

1.3.4 樣品氨基酸的測定 采用氨基酸自動分析儀分析樣品中的氨基酸。根據GB 5009.124-2016[17]中的酸水解法測定天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸含量；采用GB/T 18246-2000[18]中的堿水解法測定色氨酸；采用GB/T 15399-94[19]中的過氧化酸氧化合并酸水解法測定含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸)。

1.3.5 樣品特征參數分析 各參數均采用現行最新標準計算。

氨基酸評分(amino acid score，AAS)依據 WHO/FAO/UNU提出的標準[9]計算:

化學評分(chemical score，CS)采用FAO推薦的標準[20]計算得出:

比值系數(ratio coefficient，RC)和氨基酸比值系數分(score of RC，SRC)根據朱圣陶等[21]的模型計算:

式中，RC為被測食物蛋白質中的第i種必需氨基酸的比值系數；為被測食物蛋白質中的各比值系數的均值；n為必需氨基酸數量。

必需氨基酸指數(essential amino acid index，EAAI)依據Oser[22]提出的方法計算:

式中，p表示樣品中必需氨基酸；s表示模式譜中必需氨基酸；n為必需氨基酸數量。

蛋白質校正氨基酸計分(protein digestibility corrected amino acids score，PDCAAS)根據 WHO/FAO/UNU的方法[10]計算:

2 結果與分析

2.1 亞東黑耳中粗蛋白的分析

2.1.1 亞東黑耳的粗蛋白含量 由表1可知，亞東黑耳中粗蛋白含量為8.29 g·100g-1干重(8.29%DW)，總氨基酸含量為6.57 g·100g-1干重(6.57%DW)，略高于施樹等[23]報道的亞東地區的黑木耳中粗蛋白含量(7.58%DW)和總氨基酸含量(占干重6.37%)，但低于西藏其他地區采集的野生黑木耳[23]的粗蛋白含量(占干重14.21%～17.14%)，也低于黑木耳1、黑木耳2及人工栽培的黑木耳[24](表1)。此外，亞東黑耳的粗蛋白含量介于常見作物之間，但低于常見食用菌(表2)。

表1 木耳目代表性食用菌的粗蛋白含量Table1 Crude protein contents in typical Auriculariales foods

表2 常見作物及食用菌的粗蛋白含量Table2 Crude protein contents in crops and edible fungi

2.1.2 氮對蛋白折算系數 經測定，亞東黑耳的總氨基酸含量占粗蛋白測定量的79.2%。經計算，亞東黑耳中的氮對蛋白折算系數為4.95，接近常見食用菌中測得的4.7[29]，低于傳統使用的一般食物的折算系數(6.25)和主要糧食及經濟作物的折算系數(5.30～6.25)[16]，表明食用菌中氮對蛋白折算系數具有一定的特殊性。

2.2 亞東黑耳的氨基酸組成分析

亞東黑耳中含有常見的18種氨基酸(表3)，總量為65.74 mg·g-1DW，其中必需氨基酸(EAA)為25.17 mg·g-1DW，占總氨基酸(TAA)的38.29%，非必需氨基酸(NEAA)為 40.57 mg·g-1DW，占總氨基酸的61.71%，必需氨基酸/非必需氨基酸值(EAA/NEAA)為62.04%，超過60%，符合FAO/WHO提出的理想蛋白模式。亞東黑耳包含全部8種必需氨基酸，其中亮氨酸含量最高(5.62 mg·g-1DW)。

表3 亞東黑耳的氨基酸組成Table3 The compositions of the amino acid in proteins of Exidia sp.

2.3 亞東黑耳蛋白質的營養評估

2.3.1 亞東黑耳蛋白質中必需氨基酸的組成分析由表4可知，亞東黑耳含有豐富的必需氨基酸，其總含量為473.43 mg·g-1pro，高于常見糧食及經濟作物(273～420 mg·g-1pro)[31-33]，但作為優質植物蛋白源的大豆(369.4～427.0 mg·g-1pro)[34-35]，介于常見食用菌蛋白氨基酸含量(370.0～668.4 mg·g-1pro)之間[4，29]。亞東黑耳的必需氨基酸含量完全滿足且超過了WHO/FAO/UNU推薦的平衡模式參考值、IOM推薦模式參考值和FAO根據雞蛋蛋白改良采用的模式值，表明亞東黑耳是必需氨基酸充足的優質蛋白源。

表4 亞東黑耳蛋白中必需氨基酸的組成及比較分析Table4 Comparison of essential amino acids in proteins of Exidia sp. /(mg·g-1pro)

就單個氨基酸含量而言，亞東黑耳蛋白中的各個氨基酸基本滿足WHO/FAO/UNU(2007年)和IOM推薦的平衡模式(2005年)的需求，但除蘇氨酸和苯丙氨酸＋酪氨酸外的其他氨基酸含量均低于FAO雞蛋蛋白模式(1984年)。

2.3.2 亞東黑耳蛋白質的氨基酸營養特征分析 氨基酸評分(AAS)，即待測蛋白質中某一必需氨基酸占WHO/FAO/UNU評分模式中相應氨基酸含量的百分比，是當前評價氨基酸營養價值的主要指標[10]。亞東黑耳蛋白中除異亮氨酸外的其他必需氨基酸AAS值均大于100%(表5)，而依據現行標準計算得出的第一限制氨基酸-異亮氨酸的AAS值(98.75%)也接近100%。因此，亞東黑耳蛋白基本滿足 WHO/FAO/UNU推薦模式所要求的必需氨基酸供給，是必需氨基酸平衡充分的優質蛋白源[9]。

依照IOM提出的參照標準，亞東黑耳蛋白質中所有必需氨基酸的評分均超過100%，符合完全蛋白質的標準，可提供充足比例的、滿足人類需求的必需氨基酸，成為除傳統完全蛋白源如蛋乳制品、肉類食品和豆制品外新的完全蛋白來源[8]。與雞蛋蛋白質改良模式相比[20]，亞東黑耳蛋白質中必需氨基酸的平衡性和含量略遜色于雞蛋蛋白質，4類氨基酸(色氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸＋半胱氨酸、纈氨酸)的CS值低于或接近80%。盡管亞東黑耳蛋白質營養價值不如雞蛋蛋白質，但其仍屬于優質蛋白資源，可作為輔助食材與其他食物進行營養搭配。

在氨基酸平衡性分析中，亞東黑耳的氨基酸比值系數(RC)為0.74～1.66，蘇氨酸和異亮氨酸分別正負向偏離平衡譜最遠，蛋氨酸＋半胱氨酸最接近于1。依據朱圣陶等[21]的方法計算得到亞東黑耳氨基酸比值系數分(SRC)為70.93，該值高于部分糧食作物如高粱(47.33)和小米(53.15)，接近大米(70.50)和小麥(72.47)，略微遜色于雞蛋(81.22)。

2.3.3 亞東黑耳蛋白質的必需氨基酸指數分析 必需氨基酸指數(EAAI)是指以幾何平均數模型衡量蛋白樣本所含有的必需氨基酸相比于一種高價參比蛋白質所含必需氨基酸的整體情況[22]。經計算，亞東黑耳蛋白質的EAAI值為129.11，說明亞東黑耳蛋白質中必需氨基酸的分布與各參照模式相比較為平衡。

2.3.4 亞東黑耳蛋白質校正氨基酸計分 蛋白質校正氨基酸計分(PDCAAS)即經蛋白質消化率校正過的AAS，該模型將蛋白質的吸收利用優化納入了蛋白質質量評估的范疇[10，36]。根據食用菌的消化率(73%)[37]計算，亞東黑耳的PDCAAS值為0.72，高于約旦地區的糙皮側耳、沙漠松露、棕灰口蘑和大孢蘑菇4種蘑菇(PDCAAS值 0.35～0.45，消化率 61.4%～80.5%)[38]。

表5 亞東黑耳蛋白質的氨基酸營養特征分析Table5 Nutrition profile of amino acids in proteins of Exidia sp.

3 討論

亞東黑耳是專性寄生的野生食用菌，為黑耳屬物種而非木耳[1，3]。本研究首次對亞東黑耳的氨基酸和蛋白質進行了含量測定和營養價值評價。食品中粗蛋白和氨基酸含量與環境中氮磷等元素的水平有關[39-40]。亞東黑耳粗蛋白含量為8.29%，在食物中處于中等水平[28，31，33]，而亞東黑耳中必需氨基酸總含量達到473.4 mg·g-1pro，高于常見糧食及經濟作物，如大豆、小米、小麥、花生等[31，33，35]，與常見食用菌的必需氨基酸含量相近[4，29]。亞東黑耳的必需氨基酸總含量符合且超過了主要的氨基酸模式譜，如WHO/FAO/UNU模式、IOM推薦模式和FAO雞蛋蛋白模式[8，9，20]的需求。本研究結果表明，亞東黑耳的必需氨基酸中亮氨酸、賴氨酸和蘇氨酸相對含量較高，其中，亮氨酸對機體脂質代謝、血糖平衡和蛋白質合成分解等生理機能的維護有關鍵作用[41]；蘇氨酸是多種其他氨基酸的前體，對細胞功能和生理信號傳遞有重要影響[42-43]；賴氨酸在鈣的吸收中起重要作用，賴氨酸水平影響多個生理過程，如肌肉中蛋白質的形成，傷口愈合和荷爾蒙、酶及抗體的分泌[44]。本研究中，亞東黑耳可與第一限制氨基酸為賴氨酸的谷物食品配合食用，以達到氨基酸的平衡攝取，彌補以谷物為主糧時可能出現的賴氨酸缺乏[45]。基于膳食平衡原理，亞東黑耳的第一限制性氨基酸為異亮氨酸，必要時可以通過雞蛋、大豆蛋白質、海苔、雞肉、魚肉和其他動物食品補充[46]。

依據必需氨基酸平衡模式譜進行參數評估是分析氨基酸營養特征的主要方法[10，36]。 WHO、FAO、IOM及其合作機構曾多次改良氨基酸營養價值評估方法和平衡模式譜，從早期的雞蛋蛋白質模型、人體氮平衡模型逐步優化到現行的綜合考慮蛋白質生物利用率，針對人群蛋白質攝入需求和在食物矩陣中吸收情況的模型，并不斷根據臨床營養學研究進展及其數據庫的更新來優化氨基酸平衡模式譜[6，36]。依據現行的模型計算，亞東黑耳中各必需氨基酸分布基本符合要求，作為第一限制氨基酸的異亮氨酸AAS評分為98.75%，也接近100%。按照IOM提出的標準，亞東黑耳蛋白屬于完全蛋白質，因此，除雞蛋、乳制品、動物食品、豆制品、土豆、西藍花、腰果及配方谷物食品等完全蛋白質食物來源外，亞東黑耳蛋白質作為新發現的完全蛋白質，為營養配餐和口味改善等提供了新的可能。本研究引入WHO/FAO/UNU和IOM提出新的標準對亞東黑耳進行了評估，而國際評價標準是依據居民膳食蛋白攝入需求的變化逐步修訂的，在此推薦研究學者采用新的標準對食品中氨基酸營養進行再評價[47]。

4 結論

本研究首次引入國際最新的氨基酸平衡模式譜，通過系統分析對亞東黑耳的氨基酸特征和蛋白質品質進行評估。結果表明，亞東黑耳蛋白質中的必需氨基酸含量非常充足，比例基本合理，符合國際推行的氨基酸平衡模式譜。由于受到野生資源的產量限制，黑耳資源尚未被充分利用。隨著亞東黑耳人工栽培技術的開發和推廣，可實現其大規模生產。本研究結果為進一步發掘和利用亞東黑耳的營養價值奠定了科學基礎。