高溫脅迫下壇紫菜中紅藻糖苷及其異構體的含量變化

趙佳麗 楊 怡 趙 倩 鐘 琪 陳娟娟 楊 銳 陳海敏

(1寧波大學海洋學院，浙江寧波 315211；2寧波大學食品與藥學學院，浙江寧波 315832)

壇紫菜(Pyropia haitanensis)作為我國特有的紫菜種類，是我國浙江和福建地區主要的經濟藻種，其味道鮮美、營養豐富，富含人體所需的蛋白質、礦物質及維生素，且低脂肪、低熱量，是一種備受人們喜愛的天然海藻功能美食[1]。壇紫菜不僅具有很好的食用價值，還具有藥用價值。研究表明，壇紫菜可治療甲狀腺腫、夜盲癥等疾病[2]，還具有增強免疫功能、防止衰老、降血脂等功效[3-6]。壇紫菜養殖在環境復雜多變的潮間帶[7-8]，常處于溫度、滲透壓及輻射的劇烈變化中，其中溫度對壇紫菜的生長影響最大[9]，其適宜生長溫度為16～25℃，但近年來，隨著全球氣候變暖，每年9-10月的持續高溫天氣，使紫菜幼苗爛苗或成菜爛菜，導致壇紫菜大面積減產，對其經濟發展造成巨大威脅[10]。因此，研究壇紫菜對高溫脅迫的應答機制，以指導耐高溫紫菜品種的培育，對壇紫菜養殖業的健康可持續發展具有重大意義。

高溫脅迫是壇紫菜生長過程中常見逆境之一，壇紫菜會產生特定的應激反應，通過一些相關物質的代謝以應對該逆境。高溫脅迫條件下，細胞膜發生損傷，透性發生改變[11]，細胞內小分子外泄，導致細胞內滲透調節失衡。研究表明，紫菜中的光合同化產物紅藻糖苷可作為滲透調節劑，參與細胞內滲透壓的平衡[12-13]。紅藻糖苷具有結構清晰、生理活性豐富的特點，且只有3種簡單的異構體，即紅藻糖苷、D-異紅藻糖苷和L-異紅藻糖苷[14]，廣泛分布于各種不同類型的紅藻中。紅藻糖苷不僅可以調節滲透壓，還可作為碳庫參與細胞壁的合成、脂類代謝，有著重要的生理作用[15]。據報道，藻類中紅藻糖苷和異紅藻糖苷的含量隨著脅迫環境的不同呈不同的變化趨勢，當海藻處于低潮帶時，鹽濃度增大，暗紫紅毛菜(Bangiaatro purpurea)中紅藻糖苷的含量隨之升高，而異紅藻糖苷幾乎保持不變[16]。野外養殖的臍型紫菜(Porphyra perforata)從早上到中午紅藻糖苷含量增加4倍，到下午和傍晚時又下降[17]；從每年的二月到五月，紅藻糖苷含量隨之增加，但異紅藻糖苷的含量變化并不明顯[17]。由此說明，紅藻糖苷和異紅藻糖苷作為光合產物，其含量與光合作用有關的日長、溫度變化相關，且在滲透壓失衡情況下，也參與了滲透壓的調節。目前，針對壇紫菜養殖業遇到的高溫問題，紅藻糖苷及其異構體具體的作用機制尚未被完全了解。因此，研究高溫脅迫條件下壇紫菜中紅藻糖苷及其異構體含量的變化，有助于深入了壇解紫菜對高溫脅迫條件進行適應和應激的生理過程及機制。

本研究采取35℃作為熱激條件，該溫度作為急性應激條件，能在短時間內引起壇紫菜氧化代謝[18-20]。利用高效液相色譜-質譜聯用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)技術，以壇紫菜ME-05為對象，研究35℃高溫脅迫和20℃恢復培養條件下，不同生長階段的壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷含量的變化趨勢，旨在進一步了解潮間帶海藻對高溫脅迫的生理反應及化學分子調節機制，同時為提高壇紫菜品質和健康養殖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壇紫菜，ME-05品系，2017年采自中國浙江省與福建省的壇紫菜，陰涼處進行風干脫水并于 -80℃保存備用。樣品采集信息見表1。

表1 壇紫菜樣品采集信息Table1 The collection information of Pyropia haitanensis

甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)和醋酸銨(分析純)，美國Sigma-Aldrich公司；乙醇(分析純)、碘化鉀(分析純)，上海國藥化工有限公司。

1.2 主要儀器與設備

TSQ Quantum Access液相色譜-三重四極桿質譜聯用分析系統，美國 Thermo Fisher Scientific公司；Amide固相萃取小柱(3.0 mm×100 mm，3.5 μm)，美國Waters公司；FreeZone冷凍干燥機，美國Labconco公司；CascadaⅡ.Ⅰ超純水系統，美國 Pall公司；Precellys 24 Dual均質儀，法國Bertin公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理 將整片壇紫菜放入滅菌海水中復蘇24 h以上，挑選出健康葉片[21]，復蘇后壇紫菜葉狀體的PSⅡ原初光能轉化效率(Fv/Fm)見表2，可知冷凍復蘇后的壇紫菜生理現象與新鮮壇紫菜藻體較為接近。仔細刷洗以去除附生雜物，置于含有0.7%KI的滅菌海水中消毒10 min，然后用滅菌海水輕輕洗滌3次。壇紫菜對照組培養條件:溫度19±1℃，光照強度 20 μmol·m-2·s-1，光暗比 L ∶D=12 h ∶12 h。 熱激處理組培養條件:溫度35℃，熱激時間30 min；不同恢復時間處理:熱激后將壇紫菜取出，置于水溫為19±1℃的培養箱內分別恢復1 h和3 h，其他條件與對照組相同。上述3個處理體系的壇紫菜，取出后加液氮于-80℃冰箱保存，冷凍干燥后用液氮研磨。

表2 壇紫菜葉狀體中PSⅡ原初光能轉化效率(Fv/Fm)Table2 Chlorophyll fluorescence quantum yields of photosystemⅡ(Fv/Fm)of Pyropia haitanensis

1.3.2 紅藻糖苷的提取 準確稱取100 mg壇紫菜干粉，置于2 mL勻漿管中，然后加入1 mL 70%乙醇，使用直徑分別為0.5 mm和3 mm的破碎珠，于均質儀中提取(5 000 r·min-1，30 s×3，每次間隔 15 s，6 個循環)。在完全破碎后進行離心(5 000 r·min-1，10 min)，取上清液。將上清液中溶劑蒸發，加入1 mL 50%乙腈，稀釋50倍后，經0.22 μm濾膜過濾后用于高效液相色譜-質譜分析技術(HPLC-MS)檢測分析。

1.3.3 高效液相色譜-質譜聯用分析 色譜條件:色譜柱采用氨基柱(100 mm×3 mm，3.5 μm，美國Waters)；流動相為 10 mmol·L-1乙酸銨溶液(A)-乙腈(C)，采用等度洗脫法，流動相(A) ∶(C)=10 ∶90，保持30 min；流速 0.3 mL·min-1，柱溫 25℃，進樣量 10 μL。

質譜條件:采用電噴霧電離源負離子電離模式，噴霧電壓2.5 kV，鞘氣(N2)流量為 25 L·min-1，輔助氣流量(N2)為5 Abs，噴霧室溫度為350℃，離子傳輸毛細管溫度為350℃，碰撞氣采用氬氣，碰撞氣壓力6×10-6mbar，Q1和Q3分辨率均設定為半峰寬0.7 Da。掃描采用選擇反應監測(SRM)模式。紅藻糖苷和異紅藻糖苷相對應的離子通道和碰撞能量分別為m/z 253—m/z 119(20 eV) 和 m/z 253—m/z 89(21 eV)。

1.3.4 數據分析 所有的質譜數據操作、獲取和分析都是由Xcalibur(Thermo Fisher Scientific)軟件處理。差異性分析中，數據以平均值±標準差(mean±SD，n=3)表示。利用SPSS(版本11.5)軟件進行單因素方差分析，組與組之間差異P＜0.05時定義為差異顯著，P＜0.01時定義為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 紅藻糖苷定量方法的建立

將紅藻糖苷和異紅藻糖苷標準品進行HPLC-MS分析，獲得準分子離子峰[M-H]-離子m/z 253，再將其進行二級質譜分析，獲得二級質譜碎片離子。紅藻糖苷與異紅藻糖苷的一級和二級質譜圖非常類似，因此選擇紅藻糖苷的質譜結構解析為例進行分析。二級質譜圖中可見，母離子m/z 253分別丟失一分子甘油(92 Da)和一分子半乳糖(164 Da)獲得碎片離子m/z 161 Da和89 Da。碎片離子m/z 89繼續丟失30 Da，即丟失一分子CH2O，獲得碎片離子m/z 59；碎片離子m/z 71則是通過碎片離子m/z 89丟失一分子H2O得到的。此外，母離子m/z 253的糖環被打開，丟失134 Da獲得碎片離子m/z 119，而后繼續丟失32 Da和18 Da，即丟失一分子CH2O和H2O得到糖環碎片離子m/z 87和101。考慮結構信息和離子豐度，m/z 119反映了半乳糖糖環信息，m/z 89反映了甘油信息，因此選擇m/z 119和89作為選擇反應離子監控模式下的定量離子。紅藻糖苷的質譜裂解途徑見圖1。

圖1 紅藻糖苷的結構式及主要碎片離子Fig.1 The structures and product ions of floridoside

結合已建立的液相色譜質譜聯用定量方法[22]，以選擇反應離子模式(SRM)作為定量掃描模式，以m/z 253和m/z 119、m/z 253和m/z 89作為2條離子通道進行定量分析[22]，經HPLC-MS掃描分析后，紅藻糖苷和異紅藻糖苷標準品的出峰時間分別為16.54 min和20.02 min(圖2)。 配置 0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 μg·mL-17種濃度的混合標準品溶液，結果表示，紅藻糖苷和異紅藻糖苷在該濃度范圍內呈良好線性相關，線性回歸方程為:紅藻糖苷，y=1 079.6x＋11 632，相關系數R2=0.999 5；異紅藻糖苷，y=1 844.7x＋19 991，相關系數R2=0.998 7。

圖2 紅藻糖苷和異紅藻糖苷的離子流圖Fig.2 The ionization chromatograms of floridoside and isofloridoside

2.2 不同采集地點的壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷含量的分析

由圖3可知，隨著地理位置連續向南，日齡相近的鶴浦、洞頭、番岐頭壇紫菜中紅藻糖苷含量分別為0.64、0.66、0.61 mg·g-1，無顯著差異；異紅藻糖苷含量分別為 7.31、6.56、6.14 mg·g-1，差異顯著(P＜0.05)。鶴浦、洞頭、番岐頭壇紫菜中異紅藻糖苷含量明顯高于紅藻糖苷含量，其中，在鶴浦采集的壇紫菜中異紅藻糖苷含量最高，其次是洞頭，最后是番岐頭。

圖3 不同采集地點的壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷的含量Fig.3 Contents of floridoside and isofloridoside of Pyropia haitanensis in different collection sites

2.3 不同生長階段壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷含量的分析

由圖4可知，隨生長日齡的增長，壇紫菜中紅藻糖苷含量從Ⅰ組到Ⅳ組依次降低，分別為1.12、0.64、0.31、0.21 mg·g-1，其中絲狀體(Ⅰ)和幼嫩組(Ⅱ)中紅藻糖苷含量極顯著高于成熟組(Ⅲ)和完全成熟組(Ⅳ)(P＜0.01)。壇紫菜中異紅藻糖苷含量從Ⅰ組到Ⅳ組依次為 6.03、8.49、2.49、1.87 mg·g-1，與Ⅰ組相比，Ⅱ組異紅藻糖苷含量極顯著增加，但在Ⅲ組和Ⅳ組中異紅藻糖苷含量減少，且極顯著低于Ⅰ組、Ⅱ組(P＜0.01)。綜上，壇紫菜中紅藻糖苷及其異構體含量會隨其生理條件發生改變，以適應自然溫度的變化。

圖4 不同生長階段的壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷的含量Fig.4 Contents of floridoside and isofloridoside of Pyropia haitanensis in different growth stages

2.4 熱激處理對壇紫菜紅藻糖苷及異紅藻糖苷含量的影響

壇紫菜Ⅱ組的紅藻糖苷和異紅藻糖苷總含量相對較高，故選擇鶴浦產的壇紫菜Ⅱ組作為高溫脅迫試驗的材料。以35℃熱激30 min作為高溫組，高溫脅迫后重新置于20℃恢復培養1 h和3 h作為恢復組，以19±1℃培養條件作為對照組，由圖5可知，壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷含量對熱激處理響應類似，在35℃熱激30 min后，兩者含量均出現降低現象，分別為對照組的0.83倍和0.92倍 (P＜0.05)。經1 h恢復培養后，壇紫菜中紅藻糖苷含量增加了約1.37倍，但異紅藻糖苷含量無明顯變化；經3 h恢復培養后，壇紫菜中紅藻糖苷含量增加了1.92倍，極顯著高于對照組(P＜0.01)，異紅藻糖苷含量增加了0.04倍，顯著高于對照組(P＜0.05)。因此，選用3 h作為后續研究的關鍵時間點。

圖5 熱激應答對壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷含量的影響Fig.5 Effect of heat shock on the contents of floridoside and isofloridoside of Pyropia haitanensis

2.5 熱激處理對不同生長階段壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷含量的影響

將Ⅰ組至Ⅳ組壇紫菜樣品在35℃下刺激30 min，然后20℃條件下再恢復培養3 h。由圖6、圖7可知，Ⅰ組至Ⅳ組壇紫菜經熱激處理并恢復培養后，與對照組相比，其紅藻糖苷含量分別增加了1.50倍、1.92倍、3.31倍、3.13倍(P＜0.05)，異紅藻糖苷含量分別增加了0.97倍、1.07倍、1.60倍、1.37倍，其中Ⅰ組壇紫菜中異紅藻糖苷含量略低于對照組，但差異不顯著。綜上，不同生長階段的壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷含量在熱激處理后的變化率趨勢為:紅藻糖苷，Ⅲ組＞Ⅳ組＞Ⅱ組＞Ⅰ組；異紅藻糖苷，Ⅲ組≈Ⅳ組＞Ⅱ組＞Ⅰ組。在不同生長階段中，壇紫菜紅藻糖苷含量的變化幅度均高于異紅藻糖苷含量。表明在高溫脅迫下，紅藻糖苷作為主要滲透調節物，且其應答能力隨藻體生理條件而變化。

圖6 熱激處理對不同生長階段壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷含量的影響Fig.6 Effect of heat shock on the contents of floridoside and isofloridoside of Pyropia haitanensis in different growth stages

圖7 熱激處理對不同生長階段壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷含量變化率的影響Fig.7 Effect of heat shock on the variation rates of floridoside and isofloridoside of Pyropia haitanensis in different growth stages

3 討論

壇紫菜在遇到高溫脅迫時，將迅速進行各種熱激應答，紅藻糖苷作為滲透壓調節小分子、細胞壁合成前碳庫，承擔著重要的生理作用。環境因素如溫度、晝夜長短、潮帶水平等都會對壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷含量產生影響[23-26]，但本試驗中，隨著地理位置不斷南移，浙江鶴浦、浙江洞頭、福建番岐頭3個地點的日齡相近的養殖壇紫菜中紅藻糖苷含量差異不顯著，但異紅藻糖苷含量存在明顯差異，說明同種品系且成熟度相似的壇紫菜中紅藻糖苷含量比較穩定，不會隨著養殖地點的變化而出現較大的變化；而異紅藻糖苷含量發生變化可能是因為地理位置從北至南，海水溫度由22.4℃逐漸升高至26.8℃，略有增加，但仍處于壇紫菜耐受溫度范圍內，異紅藻糖苷可能轉化為其他代謝物以抵抗高溫。

壇紫菜的4個不同生長階段歷經夏季至冬季，溫度和光照等栽培環境在不停的變化。作為壇紫菜的二倍體生長階段，絲狀體(Ⅰ組)在一年之中溫度最高的夏季生長，說明其能夠在自然條件下耐受高溫[23，27-29]。本試驗結果表明，Ⅰ組中壇紫菜紅藻糖苷含量為4個生長階段中最高的，異紅藻糖苷含量也處于較高水平。隨著溫度的升高和白晝的縮短，絲狀體成熟且釋放殼孢子(單倍體)，在八月末和九月初形成葉狀體[30]。從九月到次年一月，Ⅱ組至Ⅳ組的海水溫度(Ⅱ組 22.4±0.2℃、Ⅲ組 18.3±0.3℃、Ⅳ組 11.8±0.2℃)逐漸降低，當低于栽培的最佳溫度(20℃)時，壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷含量減少，這是因為在低溫環境下壇紫菜的代謝速率和生長速度緩慢，說明壇紫菜中紅藻糖苷含量會隨其生理適應性發生改變，以適應自然溫度的變化。結合2.2試驗結果，紅藻糖苷可以作為紫菜選育的指標物。

細胞膜是細胞與外部環境交換信息的屏障，也是細胞內分子反應的場所。在高溫脅迫環境下，細胞膜最先被破壞，加速了整個細胞結構損傷和滲透壓的變化[11]。因此，作為滲透調節物質，35℃高溫下壇紫菜紅藻糖苷和異紅藻糖苷含量下降現象可以解釋為:首先，當細胞內滲透平衡被破壞時，紅藻糖苷和異紅藻糖苷參與代謝調節，降解成其他代謝物以改變滲透壓并保持細胞內環境平衡[11]；其次，當壇紫菜細胞壁因高溫而受損時，紅藻糖苷和異紅藻糖苷作為儲存物質參與細胞壁的合成。這與文獻報道一致，即通過使用14C標記的紅藻糖苷進行脈沖追蹤試驗，發現紅藻糖苷被作為合成細胞壁多糖的碳前體物[31-32]。當壇紫菜重新培養于合適的溫度(20℃)下，生理反應逐漸恢復到正常狀態，紅藻糖苷和異紅藻糖苷作為光合作用的主要產物[15，22]在藻類中積累，顯著高于原始含量，并儲存在藻類中以保護藻體應對脅迫環境。因此通過35℃高溫脅迫和恢復培養試驗可知，紅藻糖苷和異紅藻糖苷被作為前體物質來適應環境變化，兩者變化趨勢相似，但紅藻糖苷的波動比異紅藻糖苷更為強烈，說明紅藻糖苷的代謝調控較異紅藻糖苷更為敏感。

在早期培養階段(絲狀體組Ⅰ組和幼嫩組Ⅱ組)，壇紫菜小而脆弱，具有緩慢的代謝過程和較弱的應激能力[33-36]，本身便需要較高的貯存量以應對脅迫條件。因此，在受高溫刺激并恢復培養后，Ⅰ組和Ⅱ組壇紫菜中紅藻糖苷和異紅藻糖苷含量的變化最輕微。Ⅲ組樣品采集于壇紫菜栽培的第75天，這是壇紫菜的快速生長階段，具有最高的光合速率，生長情況較好并具有抵御環境壓力的最強能力[35-37]，此階段中紅藻糖苷和異紅藻糖苷可以快速合成以應對逆境[37-39]，與本研究結果中Ⅲ組變異率最高的現象一致。Ⅳ組(生長期第135天)壇紫菜生長于冬天，該階段壇紫菜已完全成熟，但在低溫環境下(11.8±0.2℃)壇紫菜的代謝速率和生長速度緩慢，紅藻糖苷和異紅藻糖苷應答能力弱于Ⅲ組，不過因其藻體已成熟，生長情況優于幼嫩組，且低溫環境下本身紅藻糖苷及其異構體含量較低，為助壇紫菜抵抗逆境，其變化率仍高于Ⅰ組和Ⅱ組。綜上，壇紫菜中紅藻糖苷的調節作用比異紅藻糖苷更為敏感，這與熱激試驗結果一致。

4 結論

本研究結果初步證明，逆境脅迫條件下壇紫菜紅藻糖苷及其異構體可以作為滲透調節物質參與代謝調節或作為碳前體物以合成細胞壁，當藻體重新置于適宜環境，紅藻糖苷含量顯著增加并進行貯存，以抵抗下次脅迫。壇紫菜中紅藻糖苷的變化更為敏感且具有規律性，其變化率與壇紫菜抗高溫能力相關，紅藻糖苷含量變化越大，表明壇紫菜的抗逆境能力越強；熱激處理前后異紅藻糖苷含量未發現明顯變化。相同品種、相同日齡的壇紫菜在不同地點栽培，其紅藻糖苷含量相對穩定，故可初步認為紅藻糖苷能夠作為紫菜選育過程中的一個指標物，以進一步探究壇紫菜抗高溫脅迫機理且對指導壇紫菜健康栽培具有重要的意義。