副溶血性弧菌耐藥基因的研究進展

鄭 林祝令偉郭學軍?陳 萍

（1．吉林農業大學食品與工程學院，長春130118；2．軍事醫學研究院軍事獸醫研究所／吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，長春130122）

自從1921年發現青霉素具有抗菌活性后［1］，從醫藥、農牧業到水產業，人們對于抗生素的使用日漸增加。抗生素的大量使用挽救了無數生命，也促進了農牧業產品的生產，但同時也造成了細菌耐藥性的廣泛流行。細菌獲得耐藥基因之后，還可通過轉化、轉導和接合等方式將耐藥基因傳遞到其他細菌中，甚至可以在不同種屬的細菌中傳播，使受體細菌獲得更多的耐藥性，從而增加了治療的難度。水環境是發生耐藥基因水平傳遞的最佳場所，副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是水環境中的主要病原菌，于1950年在日本首次被發現［2］。該菌的O3K6 血清型曾引起1994年印度加爾各答和1998年美國兩次大規模食物中毒事件，最后通過使用抗生素控制了疫情［3-4］。據美國疾病控制和預防中心（CDC）報道，自2001年以來副溶血性弧菌感染的發生率又開始顯著提升［5］。在美國，平均每年有215 人感染副溶血性弧菌，其中有30 人住院，1～2 人死亡［6］。用于治療副溶血性弧菌感染的推薦抗生素為四環素類、β-內酰胺類、喹諾酮類和磺胺類［7］，其中四環素或環丙沙星還可用于副溶血性弧菌的長期治療［6］。大部分副溶血性弧菌對抗生素都比較敏感，但是，近幾年副溶血性弧菌對抗生素的抗性也逐年增加。本文就近幾年副溶血性弧菌對抗生素的耐藥現狀進行對比分析，并對其耐藥機制和耐藥基因的水平轉移的研究進展進行綜述。

1 副溶血性弧菌耐藥性的現狀

1．1 美洲 通過對2005年到2014年美國的水環境、路易斯安那海灣的零售牡蠣和墨西哥加利福尼亞州的海龜樣品進行副溶血性弧菌分離和耐藥數據對比發現，副溶血性弧菌對氨芐西林具有嚴重的抗性。對比2005年在水環境分離的菌株與零售牡蠣中分離的菌株的耐藥數據，零售牡蠣中分離得到具有氨芐西林抗性的菌株分離率為57%，略高于水環境中分離得到的氨芐西林抗性菌株，但是在零售牡蠣中未分離出具有多重耐藥的菌株；在墨西哥海龜中分離的菌株與美國水環境中分離的菌株的耐藥率并無太大差別，都僅表現出對氨芐西林的抗性，對于其他的抗生素僅表現出較低的抗性。到目前為止，在美洲分離的副溶血性弧菌對于青霉素類藥物具有嚴重的抗性，對于其他類型的抗生素自2012年以后都得到了很好的控制［8-11］。

1．2 歐洲 分析2001年到2013年分別對亞得里亞海魚場、貝類、臨床樣品、新鮮及冷凍的海產品和英國的林肯郡的貝類中分離得到的副溶血性弧菌耐藥數據、并與美洲的耐藥數據對比，二者相同的是大部分副溶血性弧菌都表現出嚴重的氨芐西林抗性，但在英國的林肯郡的貝類中分離得到的副溶血性弧菌的氨芐西林耐藥率僅為1．3%，這與美洲和意大利中分離的具有氨芐西林抗性的菌株的結果出入較大。歐洲分離的副溶血性弧菌的耐藥率整體而言比美洲的要高，直到2013年，副溶血性弧菌的耐藥得到了一定的控制，但是仍然對一些弧菌屬推薦的抗生素（如氨芐西林、阿莫西林、四環素、甲氧芐啶-磺胺甲基異惡唑）具有一定的耐藥性［12-14］。

1．3 亞洲 2002年到2016年對我國東南沿海地區（包括上海市、深圳市、江蘇省、浙江省等地）中分離的77 株O3K6 血清型副溶血性弧菌進行耐藥鑒定，其中對氨芐西林、磺胺甲基異惡唑和鏈霉素的耐藥率最高，分別為84．42%、36．36%、32．47%，多重耐藥率高達14．29%。在韓國分離的副溶血性弧菌的多重耐藥率顯著高于中國，44 株中就有25 株為多重耐藥菌株，并且在2003年到2016年期間，韓國的副溶血性弧菌的耐藥率呈明顯的上升趨勢，多重耐藥率從2015年的56．8%上升到2016年的93．3%。在馬拉西亞的調查發現，副溶血性弧菌的耐藥情況也相當的嚴重，2014年的時候幾乎所有的副溶血性弧菌都對氨芐西林、青霉素、甲氧西林和新生霉素耐藥，到了第二年，氨芐西林的耐藥率有所下降，但是頭孢類及四環素的抗性卻增加，這些頭孢類及四環素抗性的菌株多來自于貝類［15-19］。

1．4 非洲 2012年和2016年對南非和尼日利亞中分離得到的副溶血性弧菌進行藥敏實驗發現，2016年在尼日利亞分離得到的菌株的耐藥率遠高于2012年在南非分離得到的菌株的耐藥率，其中2016年的分離的菌株的多重耐藥率高達67．6%，而2012年分離的菌株則僅表現出對青霉素、甲氧芐啶-磺胺甲基異惡唑和頭孢噻吩具有較強的抗性［20-21］。

2 副溶血性弧菌的耐藥機制

細菌對于外界不良環境（如危害其生存的抗生素）有很強的適應性。從進化的角度來看，細菌可采用多種方式來應對抗生素的殺傷作用。主要包括與藥物作用機制相關的基因突變、激活外排機制來排出藥物、產生水解抗生素的酶類［22］以及通過水平基因轉移（HGT）獲得編碼外源耐藥基因［22］等。

2．1 副溶血性弧菌靶位基因的改變 細菌通過基因突變產生耐藥性的機制主要是通過對抗生素作用靶位的改變來降低對藥物的親和力，從而導致藥物效果減低；也有通過突變減少細胞壁上的受體從而導致減少藥物的攝取達到耐藥。例如，喹諾酮類藥物的作用靶位是DNA 促旋酶和拓撲異構酶Ⅳ，它通過干擾DNA 的復制和轉錄功能以達到殺菌作用［23］。弧菌屬細菌可以通過gyrA突變和parC突變達到抵抗作用。gyrA基因的第83 位氨基酸ser突變為lle 或parC基因的第85 位氨基酸ser 突變為phe 均可導致副溶血性弧菌獲得喹諾酮抗性［24-26］；副溶血性弧菌編碼外膜蛋白（OMP）的vpa0116 基因也同樣與喹諾酮抗性有關，具有vpa0116 基因的副溶血性弧菌在Na+濃度增加時會對慶大霉素的耐藥性有所提高［27］。在肺炎克雷伯中發現，qnrA基因與喹諾酮的多重耐藥有關，Saga T 等在副溶血性弧菌中發現VPA0095 基因與qnrA基因互為同源染色體，具有該基因的副溶血性弧菌同樣可以對喹諾酮類藥物產生抗性［28］。

2．2 副溶血性弧菌的外排膜泵 細菌對抗生素的外排系統包括四類：主要協助蛋白轉運超家族（MFS）、小多耐藥蛋白超家族（SMR）、耐藥結節分化超家族（RND）、ATP 結合盒超家族（ABC）［29］。副溶血性弧菌中的RND 家族與副溶血性弧菌的外膜蛋白VPoC 協同作用可產生耐藥性［30］。在副溶血性弧菌中發現一個新的外排膜泵家族MATE 家族，其中的保守區域為Asp32，Glu261 和Asp367，這些氨基酸殘基在某種程度上參與了轉運過程［31］。MATE 家族中的NorM基因與大腸桿菌中的YdhE基因具有高度的同源性［29］。

2．3 副溶血性弧菌產生水解酶類 β-內酰胺類藥物可以通過破壞細菌細胞壁合成達到殺滅細菌的作用，該藥物具有毒性低作用范圍廣等特點。細菌抵抗β-內酰胺類藥物的主要機制之一是產生水解β-內酰胺的β-內酰胺水解酶［32］。弧菌屬細菌均存在VbrK／VbrR基因，該基因調控blaA 所編碼的β-內酰胺酶與β-內酰胺類抗生素的抗性有關［33］。副溶血性弧菌對頭孢菌素產生抗性比較少見，β-內酰胺酶中的blaPER-1基因、blaCMY-2基因和blaTEM基因與第三代和第四代頭孢菌素的抗性有關。副溶血性弧菌中的A 類羧芐青霉素水解β-內酰胺酶家族（CARB）blaCARB-17可產生對青霉素的固有耐藥，blaCARB-17家族中的blaV110基因同樣介導副溶血性弧菌的氨芐西林、哌拉西林和青霉素耐藥，該基因與假單胞菌屬中的PSE-4 基因具有高度同源性［34］。

2．4 副溶血性弧菌的耐藥基因水平傳遞 細菌主要以三種方式獲得外源遺傳物質，分別為轉化、轉導和接合，在細菌內部可通過整合子將多種耐藥基因重組成為多重耐藥菌，而整合子還可以以移動的基因盒的形式將新基因重組到細菌染色體或質粒等遺傳物質中［22，35］。

2．4．1 轉化 轉化是指受體菌細胞從環境中吸收裸露的外源DNA，從而獲得外源DNA 所攜帶的遺傳信息。在自然環境中只有那些處于感受態的細胞才能獲得外源DNA，該水平轉移方式在自然界中比較少見［22］。但是，最近有研究表明副溶血性弧菌的胞外DNA 可以通過特殊的生物膜而進行傳遞形成群體耐藥［36-38］。

2．4．2 轉導 轉導是指噬菌體通過尾軸將DNA 注入細菌中并進行復制，在復制過程中與細菌中的某些DNA 片段整合，然后噬菌體便可以攜帶細菌的DNA 片段進行再裝配，當該噬菌體感染其他細菌時，便將自身攜帶的供體菌DNA 片段轉移到受體菌內［22］。目前發現的副溶血性弧菌噬菌體只有vf12 和vf33 兩種絲狀噬菌體。對Vf12 和Vf33 基因組潛在的11 個開放閱讀框（ORF）和4 個未知的基因區間（IG） 的進行預測，發現了8 個ORFs（vpf243，vpf402，vpf117，vpf81，vpf77，vpf491，vpf104和vpf380）在一個方向上轉錄，3 個ORFs（vpf261，vpf122 和vpf152）轉錄的方向與其相反。其中七個ORFs 和一個IG（vpf402，vpf117，vpf81，vpf77，IG3，vpf491，vpf104 和vpf380）的組成及氨基酸數量與霍亂弧菌的CTX 噬菌體中的6 個基因和一個IG 區間極為相似（rstA，rstB，cep，orfU，ace，zot 和IG）。雖然vf12 和vf33 具有攜帶耐藥基因的能力，但目前僅發現它們與副溶血性弧菌的毒力有關，還沒有發現耐藥基因的水平轉移［39］。

2．4．3 接合 接合是指供體菌和受體菌之間的通過性菌毛進行的遺傳物質傳遞，它可以介導同種屬或不同種屬之間進行遺傳物質的水平轉移。攜帶耐藥基因的質粒、整合子和整合元件等可通過接合轉移實現不同細菌間的耐藥基因的交換和進化［22］。

2015年首次在副溶血性弧菌中的IncA／C 型接合質粒上發現了blaCMY-2基因，進而確定了該基因可以進行細菌間的水平傳播［40］。另外，在副溶血性弧菌中發現了攜帶編碼PER-1 基因的IncN質粒，該基因為超廣譜β-內酰胺酶基因，但PER-1在質粒上的遺傳機制尚不清楚［38］。也有實驗證明將抗諾氟沙星的副溶血性弧菌的pmvP36 質粒中的NorM基因導入大腸桿菌中，發現大腸桿菌對諾氟沙星，環丙沙星，卡那霉素，鏈霉素的抗性有所提升［41］。

目前在副溶血性弧菌中僅發現了1 型整合子。在副溶血性弧菌1 型整合子中已經確定了的基因盒有aadA1，dfrA1 和aacA3［42］。對β-內酰胺具有抗性的副溶血性弧菌中含有blaVEB的整合子，該整合子發現具有多重耐藥區域（MDR）與qnrVC4 基因盒［43］。

1991年在南非的環境菌株中首次發現了ICE／R391家族整合性結合元件（integrative and conjugative element，ICE VpaChn1）［44-45］。將該整合元件敲除后，可導致敲除菌株對鏈霉素，新諾明等抗生素的抗性下降［46-47］，證明ICE 能夠攜帶耐藥基因并賦予臨床和環境菌株的耐藥性。它們存在于細菌染色體中，并且可以通過綴合再次切除，轉移并整合到相容的新宿主染色體中。迄今為止，已經發現許多不同的ICE，SXT／R391 家族是弧菌屬中最常見的，該整合元件在耐新諾明的副溶血性弧菌中被發現［48］。具有SXT／R391 的副溶血性弧菌對重金屬鎘、銅、鋅和汞同樣具有高度耐受性［49］。

3 展 望

美洲與歐洲的耐藥率相對于亞洲和非洲比較呈現相對較低的狀態，幾乎所有國家分離得到的菌株都對氨芐西林耐藥，在水產品中分離獲得的副溶血性弧菌較水環境中分離得到的副溶血性弧菌耐藥率較高，并且多重耐藥菌株幾乎均來自于水產品中（如牡蠣、貝類等），副溶血性弧菌對于弧菌屬的推薦使用藥物均有不同程度的抗性。

目前來看，副溶血性弧菌的耐藥現狀并不是很嚴重，但我們不能因此就掉以輕心，對于它的耐藥機制和水平轉移還有很多盲區。雖然目前還在使用抗生素治療副溶血性弧菌感染，但由于副溶血性弧菌對弧菌屬推薦使用的抗生素目前都呈現出不同程度的抗性，尤其對氨芐西林的抗性較高，近幾年人們開始探索一些新的方法來進行抗生素的替代，例如在水中加入噬菌體、蛭弧菌、光合細菌或者其他益生菌，來進行環境副溶血性弧菌的消除，也可以對水生生物進行免疫激活劑的使用來提高它們自身的免疫力［50-51］。