合歡磁牡口服液提取工藝研究

羅永祥許加娟胡智鵬

（1．湖南圣雅凱院士工作站，湖南湘潭411228；2．湖南圣雅凱生物科技有限公司，湖南湘潭411228）

近年來，我國家禽集約化、規模化養殖發展迅速，但各種應激因素對家禽造成的危害卻并沒有得到解決，如免疫接種、轉群換料以及長途運輸等所致的應激刺激是不可避免的。由此造成家禽生長緩慢，采食量降低，飼料轉化率下降，更甚者導致機體免疫功能下降，傳染病流行。如今，越來越多研究將中藥復方制劑和應激聯系起來，中藥復方制劑也逐漸替代西藥應用于家禽養殖生產中［1］。合歡磁牡口服液是由合歡皮、磁石和牡蠣經一定工藝制成，用于緩解家禽抗應急反應的一個純中藥制劑，其中，合歡皮解郁安神做君藥，磁石、牡蠣鎮心安神輔佐合歡皮鎮靜安神。三藥合用，經口服，藥物直接作用于脾胃、腸道，并經胃腸道吸收，可有效緩解應激原所引起的躁動不安，心神不寧等應激反應，避免家禽許多潛在疾病的發生［2-3］。因此，最佳的提取工藝是有效控制合歡磁牡口服液產品質量的重要保證。

1 材料與方法

1．1 藥物 合歡皮、磁石、牡蠣均購于湖南湘眾醫藥有限公司，合歡磁牡口服液由湖南圣雅凱生物科技有限公司制備。

1．2 對照品與試劑 （-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷（C33H44O17）購自中國食品藥品檢定研究院，供含量用，批號：111911-201603；乙腈，色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸，分析純，天津市光復精細化工研究所。

1．3 主要儀器與設備 水環式真空旋轉蒸發儀，北京；電子天平（日本島津AUW220D）；高效液相6000 LDI PUMP（美國）檢測器型號：紫外；色譜柱：Uranus，C18 5 μm 4．6 mm×250 mm；色譜條件：18／82 乙腈／0．04%磷酸溶液；多功能提取罐購自湖南衡陽中一藥品機械有限公司；真空濃縮罐購自浙江溫州森博輕工機械有限公司；口服液配制罐購自浙江溫州標新機械有限公司；口服液灌裝機購自湖南長沙中和藥品機械有限公司。

1．4 方法

1．4．1 組方 合歡皮500 g、磁石250 g、牡蠣250 g，制成1000 mL。即每毫升含1 g 原生藥材。

1．4．2 水提工藝的研究 C33H44O17為合歡皮主要成分，故以測定C33H44O17含量為考察指標，用正交設計法篩選加水量、煎煮時間、煎煮次數等工藝條件。采用L9（34）進行正交試驗［4-5］。因素水平安排見表1：

表1 L9（34）正交試驗因素水平Tab 1 Level of L9（34） Orthogonal Experimental Factors

1．4．3 濃縮工藝的研究 提取按確定的生產工藝，濃縮采用單因素工藝研究，故選擇在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃（控制適宜的真空度）工藝條件下各濃縮3 批次至相對密度為1．04～1．06（60-70 ℃），加防腐劑羥苯甲脂+羥苯丙脂（9 ∶1）適量，加純化水配制成合歡磁牡口服液，每批平行測定C33H44O17含量［6］，求得平均值和RSD，考察濃縮溫度對合歡磁牡口服液C33H44O17含量的影響。

1．4．4 提取工藝驗證試驗［7-8］按最佳工藝連續生產10 批，以C33H44O17含量為考察項目。制定合歡磁牡口服液C33H44O17含量指標。

1．5 統計分析 使用Excel 數據庫記錄數據，并使用SPSS19．0 分析軟件（IBM Corporation，Armonk，NY，USA）進行統計分析。顯著性水平為P＜0．05或P＜0．01。

2 結果與分析

2．1 提取工藝正交試驗 由表2極差R 的數據分析可知：各因素的影響程度依次為C＞A＞B，即煎煮次數＞加水倍數＞煎煮時間。由表3方差分析結果表明：影響因素煎煮次數C 對產品中C33H44O17含量有顯著影響（P＜0．01），煎煮次數為C3 時C33H44O17含量最高；煎煮時間B 和加水量A 對產品中C33H44O17含量無顯著影響（P＞0．05）。

2．2 濃縮工藝研究 表4結果顯示，不同的濃縮溫度對合歡磁牡口服液中C33H44O17含量的無顯著影響（P＞0．05）。

表2 合歡磁牡口服液提取工藝正交試驗及結果Tab 2 Orthogonal experimental and results of extraction process of Hehuacimu oral liquid

表3 正交試驗方差分析Tab 3 Variance analysis of orthogonal experiment

表4 不同濃縮溫度對合歡磁牡口服液含量的影響Tab 4 Effects of different concentrated temperature on the content of Hehuacimu oral liquid

2．3 水提取工藝驗證 根據以上提取和濃縮工藝的試驗研究結果，最終采用加8 倍量的水，煎煮時間1 h，煎煮3 次，真空濃縮的工藝進行水提取工藝驗證試驗。結果見表5。結果顯示，采用該工藝提取的C33H44O17的轉移率平均值為72．37%，RSD為0．83%，對C33H44O17含量無顯著影響（P＞0．05）。

表5 水提取工藝驗證試驗結果Tab 5 Verification experimental results of water extraction process

3 討論與結論

《神農本草經》描述合歡皮作用：“主安五臟，和心志，令人歡樂無憂。”中醫藥理論將合歡皮歸為安神藥物，現代藥物書籍將合歡皮歸類安神藥。合歡皮為合歡磁牡口服液方中君藥，其主要成分為三萜皂苷、生物堿、黃酮類、木脂素和多糖等多類化學成分［9］。現代藥理學研究結果表明，水溶性的木脂素類成分為合歡皮解憂安神作用的主要活性成分［10］。夏潔等人［11］研究結果顯示，通過活性篩選實驗，發現合歡皮的安神作用與合歡皮中具有鎮靜功能的活性成份木脂素類化合物有關，其中木脂素苷的含量最高。《中國獸藥典》2015年版中合歡皮項下的含量測定以C33H44O17為質量考察指標。故本次試驗選擇C33H44O17含量測定作為產品質量考察指標。

木脂素是由苯丙素氧化聚合而成的一類化合物。多數呈游離狀態，游離的木脂素親脂性強，水溶性差。從分子結構上分析C33H44O17中連接了吡喃葡萄糖苷結構，由于葡萄糖是多羥基醛單糖，木脂素苷類水溶性大大增強，C33H44O17易溶于水，水是易得且價格低廉的溶劑，故選擇水作溶劑。本水提取工藝試驗結果表明，影響因素煎煮次數對合歡磁牡口服液的提取工藝影響顯著，選擇煎煮3 次時，C33H44O17的含量顯著升高，因此最佳參數為煎煮3 次；加水量和煎煮時間對提取工藝的影響不顯著，但從經濟角度考慮，選擇加8 倍量的水，煎煮1 h。不同的濃縮溫度對合歡磁牡口服液含量的影響無顯著差異。然而，考慮到真空濃縮過程中藥物處于密閉設備中，無外界污染風險，故將濃縮工藝確定為真空濃縮。采用本試驗總結出的此最佳工藝C33H44O17的轉移率平均值為72．37%，RSD為0．83%，對10 個批次的C33H44O17含量影響的差異不顯著，提示此工藝的重現性較好，工藝穩定。

合歡磁牡口服液標準草案中含量測定規定：合歡磁牡口服液每毫升含合歡皮以C33H44O17計，不得低于140 μg。此含量是依照《中國獸藥典》2015年版合歡皮質量標準和道地藥材合歡皮企業內控技術要求，且結合本工藝活性成分C33H44O17轉移率制定。這也提示合歡磁牡口服液中標準C33H44O17含量定量基本合理。本試驗水提取工藝驗證結果顯示，10 個批次的產品中每毫升含合歡皮以C33H44O17計的含量都遠遠高于140 μg，證明本工藝質量可控，為制定標準定量指標提供可靠依據，建議在取得新獸藥證書及生產批件后，收集道地藥材合歡皮C33H44O17含量數據，制定更高的合歡皮企業內控標準，為提升產品質量內控標準提供依據。

合歡磁牡口服液中C33H44O17含量的檢測結果在前后試驗中出現一定偏差，主要是由于不同產地的合歡皮中C33H44O17含量差距較大。通過數據分析得出，2017年試驗結果顯示C33H44O17轉移率為71．96%，與之前的轉移率72．37%比較，偏差較小。這也表明了此提取合歡磁牡口服液的工藝重現性好，工藝穩定的優點。

磁石為鎮靜安神類礦物性中藥，始載于《神農本草經》，歷代中醫文獻記載，磁石“主周痹風濕、肢節腫痛、通關節、消痛腫、明目聰耳、止金瘡血、治金瘡腫毒、斂汗止血。”。其系主含四氧化三鐵，具有聰耳明目，潛陽納氣和鎮靜安神的作用，用于治療頭暈目眩、腎虛氣喘等證。牡蠣也首載于《神農本草經》，書中將其列為上品。其中記有“牡蠣，味咸平，主傷寒寒熱，溫瘧灑灑，驚恚怒氣，除拘緩鼠瘺，女子帶下赤白，久服，強骨節，殺邪氣，延年。”至漢代，張仲景所著《傷寒論》和《金匱要略》就已經廣泛的使用牡蠣組成方劑來治療疾病。兩書中涉及到配伍牡蠣的方劑就達11 個之多，主要口服湯劑給藥。《中國獸藥典》和《中國獸藥典獸藥使用指南》中藥卷均有收載［12-13］。以上著作都不同程度上體現了牡蠣在中醫臨床上的重要的地位。近代研究還表明，牡蠣可以調節人體免疫水平，可降血脂和血壓。我們曾對磁石和牡蠣成分的提取進行研究，結果不理想，有待進一步研究。