高效液相色譜法測定清肺止咳散中黃芩苷含量

朱育紅，朱 弘

（陜西省獸藥監測所，西安710016）

清肺止咳散收載于《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部，是由桑白皮、知母、苦杏仁、前胡、金銀花、連翹、桔梗、甘草、橘紅、黃芩十味藥材經粉碎、混合而制成的中藥散劑，具有清瀉肺熱，化痰止痛的功能，主治肺熱咳嗽，咽喉腫痛。現廣泛應用于畜禽咳喘病的治療，但質量標準無含量測定方法。為了更好地控制其質量，參考文獻方法，研究建立了采用反相高效液相法測定清肺止咳散中黃芩苷的含量測定方法。

1 儀器與材料

1．1 儀器 PerkinElmer 液相色譜儀，Waters 液相色譜儀，UV 檢測器，WatersC18 柱、 安捷倫C18 柱、PerkinElmer C18 柱；Sartorius Cp225D 分析天平。

1．2 試藥與試劑 黃芩苷對照品分別來源于中國食品藥品檢定研究院（批號為110715-201720，標示含量為93．5%）和中國獸醫藥品監察所（批號為Z0271109，Z0271705 標示含量分別為98．8%、96．8%）。

清肺止咳散樣品，共10 批，其中實驗室自制小樣1 批（樣品編號1）；哈爾濱摩天農科獸藥有限公司3 批，批號分別20180514、20180515、20180516（樣品編號2-4）；河北遠征禾木藥業有限公司3批，批號分別3GN180201、3GN180202、3GN180203（樣品編號5-7）；河南環通制藥有限公司3 批，批號分別20160308、20180311、20180524（樣品編號8-10）。

清肺止咳散缺黃芩的陰性樣品，按處方及制法制成缺黃芩的陰性樣。制備小樣、缺黃芩的陰性樣的藥材均購自西安怡康大藥房。

甲醇Fisher Chemical（國藥集團化學試劑有限公司提供，色譜純，批號：178337 等）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 色譜條件 參照《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部“清解合劑”中黃芩含量測定方法。流動相：甲醇-0．3%磷酸溶液（55 ∶45）；流速：1．0 mL／min；檢測波長276 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：5～10 μL［1］。

2．2 溶液的制備

2．2．1 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇少許超聲使溶解，加50%甲醇稀釋，搖勻，制得黃芩苷對照品溶液（每1 mL 含黃芩苷0．1 mg）［2］。

2．2．2 供試品溶液的制備 取實驗室自制清肺止咳散小樣1．0 g，精密稱定，置100 mL 量瓶中，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，放至室溫，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得［2］。

2．2．3 陰性對照溶液的制備 取缺黃芩陰性樣1．0 g，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液［2］。

2．2．4 小樣測試結果 按照2．1 色譜條件，采用外標法，以峰面積計算，實驗室自制小樣每1g 含黃芩苷13．07 mg，13．13 mg，平均值為13．1 mg。

2．3 系統適用性和專屬性試驗 精密量取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10、5 μL，注入液相色譜儀，按2．1 項色譜條件測定，結果理論塔板數以黃芩苷峰計算為6374（圖1-1）、7865（圖1-2）；供試品色譜圖中黃芩苷峰與臨峰分離良好，與前峰分離度為7．0（圖2-1），與后峰分離度為2．0（圖2-2）；陰性對照色譜在與對照品色譜相同保留時間處無干擾峰（圖3-1，3-2）。結果表明，系統適用性可以滿足檢測要求；處方中其他成分對黃芩定量檢測無干擾，專屬性也能滿足檢測要求［1］。

圖1-1 黃芩苷對照品色譜圖（進樣量10 μL，Waters C18 柱，理論塔板數6374）Fig 1-1 Chromatogram of the Baicalin reference substance（Injection volume，10 μL，Column：Waters C18，Theoretical plate number：6374）

圖1-2 黃芩苷對照品色譜圖（進樣量5 μL，PE C18 柱，理論塔板數7865）Fig 1-2 Chromatogram of the Baicalin reference substance（Injection volume，5 μL，Column：PE C18，Theoretical plate number：7856）

圖2-1 供試品色譜圖（進樣量10μL，Waters C18 柱）Fig 2-1 chromatogram of the test sample（Injection volume，10 μL，Column：Waters C18）

圖2-2 供試品色譜圖（進樣量5 μL，PE C18 柱）Fig 2-2 chromatogram of the test sample（Injection volume，5 μL，Column：PE C18）

2．4 線性關系考察 取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇少許超聲使溶解，加50%甲醇稀釋，制成每1 mL 含黃芩苷0．379 mg 的對照品貯備液。取貯備液，分別精密吸取1、2、5 mL，置100 mL 容量瓶中，加50%甲醇至刻度，制成①、②、③號溶液，濃度分別為3．8、7．6、19．0 μg／mL，再分別精密吸取黃芩苷對照品貯備液5、10、20 mL，置50 mL 容量瓶中，加50%甲醇至刻度，制成④、⑤、⑥號溶液，濃度分別為38、76、152 g／mL，以黃芩苷對照品貯備液作為⑦號溶液，濃度0．379 mg／mL，按上述色譜條件，分別進樣5 μL，測定峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），以進樣濃度為橫坐標（X），進行線性回歸，得回歸方程y＝16412x-25735，R2＝0．9998（n＝7），黃芩苷在3．8～379 μg／mL 范圍內線性關系良好（見圖4、圖5）。

圖3-1 缺黃芩苷的陰性樣品色譜圖（ 進樣量10 μL，Waters C18 柱）Fig 3-1 Negative chromatogram of baicalin（Injection volume，10 μL，Column：Waters C18）

圖3-2 缺黃芩苷的陰性樣品色譜圖 進樣量5 μL，PE C18 柱Fig 3-2 Negative chromatogram of baicalin（Injection volume，5 μL，Column：PE C18）

圖4 黃芩苷線性試驗色譜峰綜合圖Fig 4 Baicalin linear test chromatogram

2．5 準確度 采用加樣回收的方法［1］

2．5．1 黃芩苷對照品母液制備 取黃芩苷對照品（Z0271705，標示含量96．8%）57．5 mg，置200 mL 量瓶中，加20 mL 甲醇超聲處理30 分鐘使溶解，放至室溫，加50%甲醇稀釋至刻度，制成母液A。

2．5．2 對照品溶液制備 取母液A 3．00 mL，加50%甲醇稀釋至10．00 mL 即得。

2．5．3 樣品制備 取樣品2、樣品7 各3 份，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，精密加入黃芩苷母液A 25 mL，按2．2 項下供試品溶液制備方法制備樣品溶液，上機測定，黃芩苷的回收率在92．9%～95．3%之間，平均回收率為94．3%，RSD為0．92%，結果見表1。

圖5 黃芩苷線性圖Fig 5 Baicalin linear graph

表1 加樣回收率試驗Tab 1 Recovries of Baicalin in preparation

2．6 精密度 重復性 取8 號樣品（批號為20160308），按2．2 項下供試品溶液制備方法，制成供試品溶液，重復進樣6 次，每次10 μL，按上述色譜條件進行測定，測定黃芩苷峰面積相對標準偏差RSD為0．21%，結果見表2［1］。

表2 精密度試驗Tab 2 Precision test

2．7 穩定性試驗 取4 號樣品（批號為20180516），按2．2 項下供試品溶液制備方法，制成供試品溶液，立即測定，再在2、4、8、12、24 h 的時間點進行測定，結果表明，測定值在24 h 內基本穩定，RSD為1．96%，結果見表3［1］。

表3 穩定性試驗Tab 3 Stability test

2．8 耐用性［1］

2．8．1 色譜柱、進樣量的耐用性 取清肺止咳散（9號樣品，批號為20180311），按2．2 項下供試品溶液制備方法制得樣品溶液，按2．1 項下色譜條件，分別在PE 液相色譜儀上用waters 柱、安捷倫柱、PE柱，在waters 液相色譜儀上用waters 柱，進樣測試含量，進樣量分別為5、10 μL，結果RSD分別為1．72%、1．12%。結果見表4。

2．8．2 流速的耐用性 取清肺止咳散（10 號樣品，批號為20180524），按2．2 項下供試品溶液制備方法制得樣品溶液，按2．1 項下色譜條件，保持流動相比例不變，于0．8 mL／min 和1．2 mL／min 流速條件下進樣5 μL 進行測試。二者測試結果相對偏差為0．71%，結果見表4。

2．8．3 流動相的耐用性 取清肺止咳散（10 號樣品，批號為20180524），按2．2 項下供試品溶液制備方法制得樣品溶液，將2．1 項下色譜條件中流動相比例調為50：50，其余保持不變，進樣5 μL，進行測試，結果與原流動相比例測得結果相對偏差為0．0%。耐用性試驗結果表明該方法能夠耐受不同液相色譜儀，色譜柱，在進樣量、流速、流動相比例等因素小范圍變化情況下，測定清肺止咳散中黃芩苷的含量無明顯差異，說明耐用性良好。

2．9 樣品含量測定 取三家企業產品，每家三批共9 批樣品，分別按2．2 項下方法制備對照品溶液及供試品溶液，精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5 μL，上機測定峰面積，通過外標法計算黃芩苷的含量，結果見表5。

表4 耐用性試驗Tab 4 Serviceability test

表5 樣品含量測定結果Tab 5 Content determination results （n=2）

3 討論與結論

3．1 含量測定成分的選擇 清肺止咳散現收載于《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部，是由桑白皮、知母、黃芩等十味藥材經粉碎、混合而制成的中藥散劑，處方量320 g，其中黃芩45 g，占14．06%，為君藥。黃芩的主要成分為黃芩苷，具有顯著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、降膽固醇、抗血栓形成、緩解哮喘、瀉火解毒、止血、安胎、抗變態反應及解痙作用，也為哺乳動物肝臟涎酶的特異性抑制劑，具有調節某些疾病的作用，也具有較強的抗癌反應生理效能。黃芩苷分子式為C21H18O11分子量（446）適中，化學性質穩定，適于作為含量測定目標成分［3］。原質量標準無含量測定方法，為了更好地控制其質量，擬定采用HPLC 測定黃芩苷的含量，并對測定方法進行了系統的考察，該方法操作簡便，黃芩苷在3．8～379 μg／mL 范圍內線性關系良好，方法準確度、精密度、日內穩定性和耐用性均能達到檢測要求。

3．2 樣品前處理方法的選擇 黃芩苷是一種黃酮類化合物，易溶于甲醇等有機溶劑。參考《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部銀黃提取物口服液含量測定項下前處理方法，本試驗采用先用少量甲醇超聲提取，再用50%甲醇稀釋，結果證明該方法能夠較為完全地提取出清肺止咳散中的黃芩苷，并且陰性無干擾。

3．3 含量測定限度的確定 擬定為每1 g 清肺止咳散中含黃芩以黃芩苷計不得低于10．0 mg。黃芩藥材收載于《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部，其含量限度規定為不得少于9．0%。實驗室自制小樣所用黃芩藥材中黃芩苷含量為9．7%，折合到清肺止咳散中，理論上應為13．6 mg／g，實測值為13．1 mg／g，黃芩苷的轉移率為96%。考慮到大生產實際，按轉移率80%、黃芩藥材中黃芩苷含量不低于9．0%計算，每1 g 肺止咳散中含黃芩苷應不得少于10．1 mg，取整數為10．0 mg。擬以此作為含量測定的限度。生產企業提供的9 批樣品中，6 批含量超出此限度，3 批未達到此限度。因黃芩苷實際無毒，上限未作規定［1］［2］。

3．4 結論 用高效液相法測定清肺止咳散中黃芩苷的含量，方法簡便，準確，靈敏度高，回收率好，可有效控制該制劑中主藥黃芩的含量，含量限度暫定為每1 g 清肺止咳散中含黃芩以黃芩苷計不得低于10．0 mg［5］。