泰地羅新注射液在藏雞體內(nèi)的藥動學(xué)研究

蒲秀花，趙 森，者永輝

（1．青海省海西州德令哈市尕海鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，青海海西州817099；2．青海省海西州動物疫病預(yù)防控制中心，青海海西州817099；3．青海省西寧市畜牧獸醫(yī)站，西寧810000）

泰地羅新（Tildipirosin，TIP）是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類半合成抗菌藥，為泰樂菌素的衍生物，其注射液于2011年在歐洲被批準生產(chǎn)上市［1］，是一種廣譜、高效的抗微生物藥物，對引起畜禽呼吸道疾病的病原菌，如胸膜肺炎放線桿菌［2］、多殺性巴氏桿菌［3］、支氣管敗血波氏桿菌［4］、副豬嗜血桿菌［5］、溶血性曼海姆菌［6］等具有特效，是治療畜禽呼吸道疾病極為理想的藥物［7］。目前，我國正處于新獸藥研究階段，有關(guān)其藥物動力學(xué)的研究報道較少，未見其在藏雞體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究報道。為了解其在藏雞體內(nèi)的吸收、分布、轉(zhuǎn)化及排泄規(guī)律，本研究建立了泰地羅新高效液相色譜檢測方法，研究了其在藏雞體內(nèi)的藥物動力學(xué)特征，為其新獸藥研發(fā)和臨床使用提供理論參考。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

1．1．1 試驗藥品 泰地羅新標準品（批號：T440150，純度98．2%）購自美國加拿大Trc 公司，準確稱取泰地羅新標準品100 mg 溶于50 mL 甲醇中，配制成2．0 mg／mL 的泰地羅新標準品標準溶液，避光保存；泰地羅新注射液（批號：1303001，規(guī)格50 mL）山東齊魯動物保健品有限公司提供。乙腈、甲醇：色譜級，購自美國Thermo 公司；甲酸、磷酸二氫鉀：分析純，購于國藥集團。

1．1．2 試驗儀器 美國Agilent1200 型高效液相色譜儀，自動進樣器、紫外檢測器，Agilent ZORBAX SB-C18 柱（250 mm×4．6 mm，5 μm） ；TG-16W 高速離心機：長沙湘儀離心機有限公司；萬分之一電子天平，德國賽多利斯公司；XH-B 渦旋混合器：江蘇康佳醫(yī)療器械有限公司；氮吹儀：N-EVAPTM111型，美國路易公司。

1．1．3 試驗動物 藏雞12 羽，體重（650±50） g，購于海西州藏雞養(yǎng)殖戶。自由飲水和采食，飼料為不含任何藥物的全價商品日糧，飼養(yǎng)在試驗雞舍中，溫度控制在（20±2）℃。在試驗前觀察飼喂1 周；試驗前12 h 禁食，自由飲水；試驗期間自由采食和飲水。

1．2 試驗方法

1．2．1 色譜條件 經(jīng)過多次試驗，確立泰地羅新的高效液相色譜檢測條件為：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18 柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；檢測波長為289 nm；流動相為甲醇-乙腈-0．05 mol／L磷酸二氫鉀溶液（pH7．00）＝（35 ∶30 ∶35）；流速為1．0 mL／min；進樣量為20 μL；柱溫為（30±0．1）℃。

1．2．2 藥物動力學(xué)試驗設(shè)計 根據(jù)泰地羅新的推薦使用劑量，12 羽藏雞以4 mg／kg．bw 的劑量肌內(nèi)給藥。給藥后分別于0．0833、0．25、0．5、1、2、4、6、8、10、24、48、72、96、120、144、192、240、288 和336 h于翼下靜脈采血2 mL，置于已添加肝素鈉的聚丙烯離心管中，以3000 r／min 離心15 min，取上清液于-20 ℃冷凍保存，待測定。

1．2．3 血漿樣品處理 準確吸取血漿0．5 mL，分別加入3．0 mL 乙腈提取2 次，每次渦旋振蕩1 min，4000 r／min 4 ℃離心10 min；合并2 次提取液取上清于10．0 mL 尖底離心管中，45 ℃氮氣吹干，再用200 μL 流動相溶解，渦旋振蕩1 min，10000 r／min 4 ℃離心10 min，取上清液即為待測樣品。

1．2．4 血漿標準曲線的建立 向8 支10．0 mL 聚丙烯離心管中各加入0．5 mL 空白血漿，留一支作空白對照，然后依次加入泰地羅新標準工作液，便得到藥物濃度依次為0．01、0．05、0．10、0．50、1．00、2．00、2．50 μg／mL 的血漿樣品。分別按照泰地羅新血漿樣品處理方法處理后，進樣分析。以測得泰地羅新的峰面積（A）為橫坐標，藥物濃度（C）為縱坐標，建立標準曲線，得出泰地羅新回歸方程。

1．2．5 方法學(xué)驗證 取空白血漿0．5 mL，添加適量泰地羅新標準工作液，使其濃度分別為2．50、1．00、0．10 μg／mL，按照血漿樣品的處理方法處理，進行HPLC 檢測，每個濃度設(shè)置5 個平行，測定日內(nèi)變異系數(shù)；重復(fù)檢測5 d，測定日間變異系數(shù)；并計算其回收率。

1．2．6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 方法學(xué)驗證考察數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件分析處理；藥-時曲線圖和消除動態(tài)圖采用Excel 軟件繪制；藥物動力學(xué)模型擬合及參數(shù)計算均采用3P97 藥動學(xué)軟件分析計算。

2 結(jié)果與分析

2．1 方法專屬性 通過反復(fù)多次試驗所建立的色譜條件，基線平穩(wěn)，藥物峰形良好，泰地羅新在色譜條件下均能與雜質(zhì)峰良好分離。結(jié)果表明，本測定方法簡便，雜質(zhì)峰干擾小、分離度良好，泰地羅新出峰時間為14．2 min，空白血漿和血漿中添加藥物色譜圖見圖1和圖2。

根據(jù)標準曲線建立的方法，以測得泰地羅新的峰面積（A）為橫坐標，藥物濃度（C）為縱坐標，建立標準曲線如圖3。泰地羅新在0．01～2．5 μg／mL的濃度范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為C＝0．0008A+0．0174，相關(guān)系數(shù)為0．9999。

2．2 方法學(xué)驗證 在空白血漿中添加泰地羅新標準工作液，使其濃度分別為0．10、1．00、2．50 μg／mL，按血漿樣品處理，HPLC 檢測，每個濃度設(shè)置5 個平行，測定日內(nèi)變異系數(shù)在5%以內(nèi)；重復(fù)檢測5 d，測定日間變異系數(shù)在10%以內(nèi)；回收率為89．19%～91．36%；檢測限（LOD）、定量限（LOQ）分別為0．01、0．05 μg／mL。具體數(shù)據(jù)如表1。

2．3 藥物動力學(xué)數(shù)據(jù) 按照試驗設(shè)定方案進行給藥和樣品處理，經(jīng)高效液相色譜分析檢測、軟件分析計算。藏雞肌內(nèi)注射泰地羅新各時間點藥濃度見表2，藥物動力學(xué)參數(shù)見表3。

圖1 空白血漿對照色譜圖Fig 1 Chromatograms of control plasma

圖2 血漿0．1μg／mL 色譜圖（A 為泰地羅新）Fig 2 Chromatograms of Tildipirosin in Tibetan Chicken plasma（0．1 μg／mL）

圖3 泰地羅新在血漿中的標準曲線Fig 3 Standard curve of determination of Tildipirosin in pigs plasma

表1 泰地羅新在血漿中的方法學(xué)考察數(shù)據(jù)（n=5）Tab 1 The result of method validation of Tildipirosin in plasma （n=5）

續(xù)表

表2 藏雞肌內(nèi)注射泰地羅新（4 mg／kg．bw）后各時間點的血藥濃度（n=12）Tab 2 Plasma concentration vs time after a single 4 mg／kg．bw im Tildipirosin Injection in Tibetan Chicken（n=12）

表3 肌內(nèi)注射泰地羅新4 mg／kg．bw 在藏雞體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)（n=12）Tab 3 Pharmacokinetic parameters of Tildipirosin（4 mg／kg．bw） in Tibetan Chicken（n=12）

由表1、2可見，泰地羅新肌內(nèi)注射后，在藏雞體內(nèi)吸收迅速，達峰時間快，達峰濃度較高，消除半衰期較長，藥-時曲線（圖4）符合有吸收三室開放模型，其藥-時方程為C＝0．4461e-0．1748t+0．3721e-0．0257t+0．2903e-0．0074t-1．1086e-2．0134t。

圖4 泰地羅新肌內(nèi)4 mg／kg．bw 給藥的血藥濃度-時間曲線Fig 4 Changing curve of Tildipirosin plasma concentration vs time after a single 4 mg／kg．bw im Tildipirosin Injection in Tibetan Chicken

3 討論與結(jié)論

藏雞是至今世界上在高海拔生活歷史較為悠久的原始地方小型雞種，其體型輕小、胸腿肌肉發(fā)達、極耐粗飼、抗病力強，肉質(zhì)鮮嫩、風(fēng)味獨特，營養(yǎng)豐富，藥用價值極高，對高原惡劣的氣候和低氧環(huán)境有良好的適應(yīng)能力，是藏區(qū)養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展極其重要的品種資源［8-9］。研究泰地羅新在藏雞體內(nèi)的藥物動力學(xué)特征，對了解其在機體內(nèi)的變化規(guī)律，指導(dǎo)臨床合理科學(xué)的使用意義重大。

研究表明，單劑量肌內(nèi)注射泰地羅新（4 mg／kg．bw）后，在藏雞體內(nèi)的藥-時曲線符合有吸收三室開放模型；Tmax為（1．727±0．237） h，Cmax為（0．938±0．121）μg／mL，t1／2為（36．198±2．394） h，AUC 為（55．564±3．675） μg·h／mL，Vd為（16．155±2．676） mL／kg。Rose 等［10］報道，豬單劑量給泰地羅新4 mg／kg．bw，Tmax為（0．38±0．14） h，Cmax為（0．895±0．453） μg／mL，t1／2為（106±15） h，AUC 為（11．012±2．989） μg·h／mL；Menge 等［11］報道，給牛單劑量皮下注射4 mg／kg．bw泰地羅新，Tmax為0．383 h，Cmax為0．7 μg／mL，T1／2為216 h；郭美珍［12］報道皮下注射泰地羅新在健康小鼠血漿的Tmax為0．083 h，t1／2為（14．123±1．758） h。由此可知，本研究結(jié)果與泰地羅新在豬、牛及小鼠體內(nèi)的Tmax有一定的差距，即在藏雞體內(nèi)達峰時間相對較長；在Cmax方面與國內(nèi)外相關(guān)報道基本相似；泰地羅新在藏雞體內(nèi)的t1／2為（36．198±2．394） h，較其在小鼠體內(nèi)（14．123±1．758） h 長，較豬（106±15） h、牛216 h 均較短；這可能與動物種類及高原環(huán)境有一定的關(guān)系。泰地羅新注射液在藏雞體內(nèi)達峰時間短，在機體內(nèi)轉(zhuǎn)運速度快，這可能與泰地羅新本身脂溶性較高有關(guān)。泰地羅新在藏雞體內(nèi)的半衰期約為36 h 左右，說明其在藏雞體內(nèi)消除慢、血漿清除率低，藥效持久。與大環(huán)內(nèi)酯類的其他藥物相比，泰地羅新以單劑量肌肉注射給藥就可以保持較長的藥物濃度，不需要多次重復(fù)給藥，對耐藥性的控制和臨床治療效果的發(fā)揮具有較大的優(yōu)勢［10，13］。因此，本研究將對泰地羅新的新獸藥研發(fā)和臨床使用提供重要參考。