生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞制備水貂犬瘟熱活疫苗

馮二凱，程悅寧，羅國良，易 立，王振軍，郭 利，陳立志，程世鵬?

（1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春130112；2．吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司，長春130122）

水貂犬瘟熱（Mink canine distemper，CD）是由犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）引起一種高度接觸性傳染病［1］，與水貂阿留申病、細(xì)小病毒性腸炎并稱為水貂養(yǎng)殖業(yè)的“三大殺手”，每年都給我國水貂養(yǎng)殖企業(yè)或養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅水貂養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展［2-4］。目前水貂犬瘟熱沒有特效的治療藥物，僅能通過疫苗免疫預(yù)防。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所先后研制了第一代水貂犬瘟熱雞胚成纖維細(xì)胞疫苗［5］和第二代水貂犬瘟熱活疫苗（傳代細(xì)胞源）［6］，疫苗研制為有效控制我國毛皮動物犬瘟熱疫情的發(fā)生和流行奠定了基礎(chǔ)。但是，伴隨著生物制品生產(chǎn)規(guī)模不斷擴大，工藝水平不斷提升，傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶工藝已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代疫苗企業(yè)的生產(chǎn)需求；另一方面，伴隨著我國規(guī)模化養(yǎng)殖進(jìn)程加速以及各種重大疫情頻發(fā)的現(xiàn)實，疫病正在成為養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的主要風(fēng)險，一旦發(fā)生疫情，損失慘重。因此規(guī)模化養(yǎng)殖廠需要優(yōu)質(zhì)、高效疫苗［5］。本研究在前期初步掌握Vero 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝參數(shù)基礎(chǔ)上［7］，繼續(xù)優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)方式、病毒最佳感染復(fù)數(shù)以及病毒感染時間等參數(shù)，建立水貂犬瘟熱Vero 細(xì)胞活疫苗（CDV3-CL 株）的懸浮培養(yǎng)制備工藝，研制新型水貂犬瘟熱高質(zhì)量疫苗。

1 材料與方法

1．1 材料 犬瘟熱病毒（CDV3-CL 株，105．0TCID50／0．1mL），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所鑒定和保存；Vero 細(xì)胞（CCL-81），購自ATCC。新生牛血清（批號：20160405），由內(nèi)蒙古金源康生物提供；MEM（批號：1823760）、DMEM（批號：1693945）和DMEM 低糖（批號：31600-091）由Gibco 公司提供；DMEM／F12（批號：66005-050），由甘肅健順生物提供；二氯二甲基硅烷（硅油：批號F1721024）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。7L 生物反應(yīng)器購自廣州齊志生物工程股份有限公司。

1．2 反應(yīng)器處理 于通風(fēng)櫥內(nèi)，取少量硅油均勻涂抹反應(yīng)器以及2 L 藍(lán)蓋瓶內(nèi)壁，倒置、自然晾干后，利用無水酒精中和，自來水沖洗6～7 次，雙蒸水洗滌3 次，于60 ℃烘箱內(nèi)烘干備用。

1．3 微載體處理 取已硅化藍(lán)蓋瓶，稱取適量微載體，按照100 mL／g 微載體的比例加入無Ca2+、Mg2+的PBS，于4 ℃浸泡過夜；棄PBS 和漂浮微載體，按200 mL／g 微載體的比例加入無Ca2+、Mg2+的PBS，校正電極、安裝生物反應(yīng)器、120 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至室溫備用。

1．4 細(xì)胞培養(yǎng)及優(yōu)化 以不同培養(yǎng)基（MEM、DMEM、DMEM（低糖）、DMEM／F12）以及不同初始接種密度接種生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)種子細(xì)胞，每天檢測細(xì)胞密度、監(jiān)測葡萄糖消耗量，根據(jù)葡萄糖消耗量和細(xì)胞生長情況，篩選合適的細(xì)胞培養(yǎng)基、初始接種密度以及合適的培養(yǎng)方式（批次、流加和灌流）。

1．5 病毒原液制備 以不同病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）（0．01、0．001、0．0001）的CDV 分別接種懸浮培養(yǎng)種子細(xì)胞，測定不同MOI對CDV 滴度的影響，確定最佳MOI。接毒后每24 h取樣測定CDV 效價，確定最佳收獲時間（TOI）。

1．6 工藝驗證 采用確定的水貂犬瘟熱Vero 細(xì)胞活疫苗懸浮培養(yǎng)工藝分別制備3 批水貂犬瘟熱病毒液，測定其病毒TCID50，驗證工藝參數(shù)的穩(wěn)定性。

1．7 病毒滴度測定 病毒滴度參照常規(guī)方法測定，按照公式Reed-Muench 法計算病毒樣品的TCID50。

1．8 疫苗制備 利用驗證后工藝參數(shù)制備配苗病毒液，無菌檢驗合格、配制、分裝、凍干；按照《中國獸藥典》第三部附錄完成疫苗物理性狀、無菌、支原體和外源病毒檢驗等。

2 結(jié) 果

2．1 培養(yǎng)基對種子細(xì)胞、病毒增殖的影響 圖1顯示4 種商業(yè)化培養(yǎng)均能支持Vero 細(xì)胞生長，但DMEM（低糖）、MEM 培養(yǎng)基在培養(yǎng)72 h 后，細(xì)胞密度相對較低；而DMEM、DMEM／F12 都能支持Vero細(xì)胞高密度培養(yǎng)，其中以DMEM 培養(yǎng)基支持Vero細(xì)胞增殖效果最佳。

圖2顯示不同培養(yǎng)基條件下對懸浮細(xì)胞進(jìn)行接毒后的病毒滴度情況，從中可以看出DMEM 培養(yǎng)條件下的CDV 增殖效果最佳。

2．2 初始接種密度對種子細(xì)胞增殖以及培養(yǎng)方式的影響 圖3是不同初始接種密度對種子細(xì)胞培養(yǎng)密度及培養(yǎng)周期的影響。細(xì)胞接種后24 h，60 cells／球?qū)嶒灲M的細(xì)胞密度略有下降，與39 cells／球?qū)嶒灲M基本持平，但高于20 cells／球?qū)嶒灲M；細(xì)胞接種后48 h，細(xì)胞密度迅速上升，60 cell／球?qū)嶒灲M細(xì)胞密度最高，39 cells／球次之，20 cells／球最低；培養(yǎng)至72 h，60 cells／球和39 cells／球?qū)嶒灲M的細(xì)胞密度可達(dá)到200 cells／球以上，滿足了接毒要求；而初始接種密度為20 cells／球時，需要一直培養(yǎng)至144 h，才滿足接毒要求。不同初始接種密度不僅影響培養(yǎng)細(xì)胞的密度和培養(yǎng)周期，而且還影響細(xì)胞培養(yǎng)的方式。以60 cells／球接種時，細(xì)胞在接種后24 h 即出現(xiàn)葡萄糖濃度不足，不得不改用灌流方式培養(yǎng)；而以20 cells／球接種時，細(xì)胞培養(yǎng)周期延長，雖然前期不需要灌流，但是后期也需要長時間的灌流培養(yǎng)才能獲得滿足接毒要求的細(xì)胞密度；而以39 cells／球接種時，在0～48 h 僅批培養(yǎng)即可；48 h～72 h 采用灌流方式讓細(xì)胞快速增殖，以滿足反應(yīng)器接毒需求。

圖1 不同培養(yǎng)基支持Vero 細(xì)胞增殖效果Fig 1 The influence of medium on the proliferation of Vero cell

圖2 不同培養(yǎng)基支持水貂犬瘟熱增殖效果Fig 2 The influence of medium on the proliferation of canine distemper virus

圖3 初始接種密度對Vero 細(xì)胞增殖的影響Fig 3 The effect of the initial inoculation density on the proliferation of Vero cell

2．3 培養(yǎng)方式對Vero 細(xì)胞增殖的影響 圖4直觀地顯示了培養(yǎng)方式對Vero 細(xì)胞增殖的影響。相對于批次培養(yǎng)，DMEM（批次+灌流），DMEM／F12（批次+灌流），甚至MEM（批次+灌流），均可以顯著提升Vero 細(xì)胞的細(xì)胞密度；其中DMEM（批次+灌流），DMEM／F12（批次+灌流）均可以在培養(yǎng)第72 h范圍內(nèi)使Vero 細(xì)胞滿足接毒要求。

2．4 最佳MOI 和TOI 確定 圖5顯示的是不同感染復(fù)數(shù)MOI 對CDV 滴度的影響。過高的MOI（0．01和0．04），導(dǎo)致細(xì)胞快速從微載體上脫落（48 h），病毒滴度較低（圖5C 和5D），說明MOI 能夠直接影響病毒增殖效率。當(dāng)MOI 為0．0006 和0．0003 時，病毒增殖時間延長，均可以獲得較高地的CDV 增殖效價，其中MOI ＝0．0006 效價最高，達(dá)到107．2TCID50／0．1mL（圖5A），病毒的峰值均出現(xiàn)在120 h左右（圖5A 和B），所以確定CDV 的最佳MOI 為0．0001～0．001，確定CDV 的最佳TOI 在100～120 h之間。

圖4 培養(yǎng)方式對Vero 細(xì)胞增殖的影響Fig 4 The influence of culture mode on the proliferation of Vero cell

圖5 不同感染復(fù)數(shù)對CDV 病毒效價的影響Fig 5 The MOI effect on tilter of CDV

2．5 工藝重復(fù)性驗證 為了驗證工藝的重復(fù)性，利用建立的水貂犬瘟熱Vero 細(xì)胞活疫苗懸浮培養(yǎng)工藝參數(shù)重復(fù)培養(yǎng)水貂犬瘟熱病毒（CDV3-CL 株）3 次，對每次獲得的病毒液進(jìn)行滴度測定，結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出，建立的工藝參數(shù)具有很好的重復(fù)性。

圖6 水貂犬瘟熱Vero 活疫苗懸浮工藝重復(fù)性驗證Fig 6 The repeatability test of the suspension culture craft for preparing mink canine distemper attenuated lived vaccine

3 討 論

毛皮動物養(yǎng)殖極易受到疫病威脅，急需高質(zhì)量疫苗為行業(yè)健康發(fā)展保駕護(hù)航［5］。然而目前毛皮動物疫苗大多采用轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)，需要使用高濃度血清，生產(chǎn)的疫苗批間差異大，無法滿足市場對高質(zhì)量疫苗的需求，亟需對疫苗的制備工藝進(jìn)行升級換代。

本研究基于已有的水貂犬瘟熱活疫苗（CDV3-CL 株）的轉(zhuǎn)瓶工藝參數(shù)，通過控制參數(shù)法對疫苗的懸浮培養(yǎng)制備工藝關(guān)鍵參數(shù)，例如培養(yǎng)基、初始接種密度、培養(yǎng)方式以及病毒MOI 以及TOI 等進(jìn)行系統(tǒng)摸索和優(yōu)化。以培養(yǎng)基為例，本研究發(fā)現(xiàn)所有培養(yǎng)基（MEM、DMEM、DMEM（低糖）、DMEM／F12）均可以維持Vero 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，但它們所能支持Vero 細(xì)胞增殖和病毒增殖的能力有差異：MEM 最弱，DMEM（低糖）次之，DMEM 最高（批次培養(yǎng)，圖1和圖2）；與夏德鎮(zhèn)等［7］報道略有不同，其利用MEM 培養(yǎng)基通過灌流培養(yǎng)可以支持3～20 g／L 微載體高密度培養(yǎng)Vero 細(xì)胞，但最高密度出現(xiàn)時間在120～140 h 之間。為了能在最短時間內(nèi)獲得較高的細(xì)胞密度，以便于與傳統(tǒng)疫苗制備周期持平，試驗選擇了能夠更好支持細(xì)胞增殖的DMEM 作為生產(chǎn)培養(yǎng)基。

細(xì)胞初始接種密度高或低以及微載體用量也是懸浮工藝開發(fā)的關(guān)鍵參數(shù)，因為其不但影響細(xì)胞培養(yǎng)周期，而且影響細(xì)胞的培養(yǎng)方式。韓中山等［8］在研究狂犬病毒懸浮制備工藝過程中，發(fā)現(xiàn)較高的初始接種密度會增加營養(yǎng)物質(zhì)的消耗速率，需要通過灌流培養(yǎng)才能維持細(xì)胞增殖。本研究也有同樣的發(fā)現(xiàn)，以60 cells／球為例，在培養(yǎng)早期（24～36 h）就需要對細(xì)胞進(jìn)行換液或灌流培養(yǎng)；而細(xì)胞初始密度為20 cells／球時，雖然在培養(yǎng)早期不需要灌流培養(yǎng)，但其培養(yǎng)周期被延長至144 h 才滿足接毒要求，隨著培養(yǎng)時間的延長也需要進(jìn)行換液或灌流操作；此外，較高的細(xì)胞密度會增加初始細(xì)胞的用量，在規(guī)模化生產(chǎn)過程中會增加初級種子的用量以及操作步驟，增加污染風(fēng)險。

培養(yǎng)方式對工藝的影響主要體現(xiàn)在營養(yǎng)物質(zhì)工藝和代謝廢物清除兩個方面。批次培養(yǎng)模式提供的營養(yǎng)物質(zhì)不足以支持細(xì)胞高密度、長期培養(yǎng)，并且會造成代謝廢物積累。Trabelsi K 等［9］在利用不同模式培養(yǎng)Vero 細(xì)胞生產(chǎn)狂犬病毒過程中發(fā)現(xiàn)，其乳酸的積累要高于灌流培養(yǎng)，細(xì)胞密度卻低于灌流培養(yǎng)。

病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）及病毒感染時間（TOI），主要影響病毒的增殖以及病毒收獲時間。不同的病毒的MOI 和TOI 也不盡相同。在本研究早期，利用高M(jìn)OI（0．01 和0．04）感染Vero 細(xì)胞，細(xì)胞在48 h即幾乎全部脫落（數(shù)據(jù)未提供），病毒未能得到很好增殖，病毒滴度也較低（圖3A）；當(dāng)MOI 調(diào)整為0．0006 時，病毒增殖周期從原來的48 h 延長至144 h，病毒的滴度也大幅提升（107．2），較轉(zhuǎn)瓶工藝提升了近2 個滴度，極大地提升了疫苗的制備效率，降低了疫苗批次間的差異。

綜合考慮以上因素，通過優(yōu)化組合形成了適合水貂犬瘟熱Vero 細(xì)胞活疫苗的懸浮制備工藝：培養(yǎng)基選擇DMEM，微載體用量規(guī)定為5 g／mL，細(xì)胞初始接種密度設(shè)定為30～40 cells／球，培養(yǎng)方式為批次+灌流培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞72～96 h 左右或細(xì)胞密度達(dá)到200 cells／球以上時，以MOI 為0．0001～0．001的比例接種水貂犬瘟熱病毒CDV3-CL 株，調(diào)低培養(yǎng)溫度（33 ℃）繼續(xù)培養(yǎng)100～120 h，收獲病毒液，即可用作配制疫苗的半成品。按照《中國獸藥典》三部（2015 版）的規(guī)定完成半成品的相關(guān)檢驗，即可稀釋、分裝、配苗。本研究為水貂犬瘟熱Vero細(xì)胞活疫苗規(guī)模化懸浮生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。