加味涼血消風散對尋常型銀屑病血熱證JAK3/STAT3通路BCL-2、P53蛋白水平影響

胡霞 譚紅雁 譚雯 郝平生

摘要：目的?分析加味涼血消風散對Janus激酶信號轉導子與轉錄激活子（The Janus kinase/signal transducer and activator of tran-scriptions，JAK/STAT）通路中凋亡相關因子蛋白水平的影響，探究凋亡特征和作用微觀機制。方法?Western Blot檢測實驗組治療前后和對照組血清中JAK3、STAT3、BCL-2、P53表達水平。結果?實驗組治療前與對照組比：JAK3、STAT3、BCL-2偏高而P53偏低（P<0.01）;實驗組治療后與治療前比：P53上升而JAK3、STAT3、BCL-2下降（P<0.05）。結論?JAK3/STAT3信號通路活化、細胞凋亡受抑可能是發病機制之一;加味涼血消風散可能通過下調JAK3/STAT3通路活化調節P53、BCL-2蛋白水平，促進細胞凋亡，達到治療血熱證尋常型銀屑病的目的。

關鍵詞：尋常型銀屑病;JAK3/STA3信號通路;BCL-2;P53;加味涼血消風散

中圖分類號：R758.63??文獻標志碼：A??文章編號：1007-2349（2019）12-0022-06

【Abstract】Objective： To analyze the effect of modified Liangxue Xiaofeng Powder on the levels of apoptosis-related factor proteins in Janus kinase signal transducer and activator of tran-scriptions （JAK/STAT） pathway and explore the microscopic mechanisms of apoptotic features and effects. Methods： Western Blot was used to detect the expression levels of JAK3， STAT3， BCL-2 and P53 in the serum of the experimental group before and after treatment. Results： Compared with those of the control group before treatment， JAK3， STAT3， BCL-2 of the experiment group were higher and P53 was lower （P<0.01）. The experimental group was compared with that before treatment， P53 increased and JAK3， STAT3， BCL-2 decreased （P<0.05）. Conclusion： The activation of JAK3/STAT3 signaling pathway and the inhibition of apoptosis may be one of pathogenesis. Modified Liangxie Xiaofeng Powder may regulate P53 and BCL-2 protein levels and promote apoptosis by down-regulating JAK3/STAT3 pathway activation in order to achieve the purpose of treating blood heat syndrome of psoriasis vulgaris.

【Key words】psoriasis vulgaris， JAK3/STA3 signaling pathway， BCL-2， P53， modified Liangxue Xiaofeng Powder

銀屑病是一種多基因遺傳的慢性炎癥性皮膚病，以紅斑鱗屑為主要表現，臨床以尋常型多見，占97.9%[1]。病機不明確，誘因眾多，使該病具難治愈易復發的特點，明確其發病機制，探討臨床起效微觀機制，一直是該鄰域研究熱點。銀屑病發病原因不詳，但病理改變確切，主要病理改變表現為角質形成細胞（Keratinocyte，KC）過度增殖和分化不全，近年研究又發現KC細胞凋亡與銀屑病發病密切相關，細胞凋亡的增加可能是為改善過度增殖，而JAK/STAT通路作為介導細胞因子信號內傳的通路，參與銀屑病形成，在KC增殖、凋亡、免疫調節等多方面發揮作用。臨床研究已證實加味涼血消風散對血熱證尋常型銀屑病有較好的療效[2]，前期研究證實其有抗炎、抑制KC角化、抑制增殖細胞核抗原及調控TNFR1等作用[3-4]。但該中藥復方辨治血熱證的微觀物質基礎與影響JAK/STAT通路及細胞凋亡之間的關系尚未明確，故筆者進一步檢測加味涼血消風散治療尋常型銀屑病血熱證前后血清中P53、BCL-2凋亡因子及JAK3、STAT3信號因子蛋白表達情況，與對照組比較，分析KC細胞凋亡及JAK/STAT通路在尋常型銀屑病中作用，探討加味涼血消風散對細胞凋亡和JAK/STAT信號通路的影響，總結加味涼血消風散治療尋常型銀屑病血熱證的部分微觀機制。本研究已獲得四川中醫藥區域倫理審查委員會的批準書及受試者簽署的知情同意書。

1?材料與方法

1.1?臨床資料?符合尋常型銀屑病血熱證納入標準的患者10例作為實驗組，來源于2016年6月-2017年6月四川省中醫院皮膚科門診患者，男女各5例，平均年齡（40.20±12.53）歲，病程6月-20年，平均病程（97.20±87.67）月，病情及嚴重程度指數（PASI）評分為（16.20±3.90）。臨床健康志愿者10例作為對照組，來源于成都中醫藥大學學生及健康體檢者，其中男4例，女6例，平均年齡（31.40±5.17）歲。2組比較，差異無統計學意義（P>0.05），具可比性。

1.2?診斷標準?尋常型銀屑病西醫診斷標準據張學軍主編《皮膚性病學》制定[5]，血熱證中醫診斷標準據歐陽恒主編《新編中醫皮膚病學》及2002 年版《中藥新藥臨床研究指導原則》[6-7]制定。

1.3?納入標準?實驗組：①符合尋常型銀屑病診斷標準及血熱證辨證要求;②簽署知情同意書時年齡18歲-70歲;③未合并其他皮膚病;④無心、腦、肝、腎系統等嚴重原發疾病，慢性消耗性疾病及精神疾病;⑤近1個月內未接受系統糖皮質激素、維甲酸類和免疫抑制劑治。對照組：①簽署知情同意書時年齡18歲-65 歲;②無銀屑病家族遺傳史;③無嚴重系統性疾病、腫瘤、免疫缺陷或精神障礙者;④近1個月內未使用激素或免疫抑制劑等。

1.4?排除標準?實驗組：①不符合診斷標準和納入標準;②雖符合診斷標準，但有下列情況之一者：屬膿皰型、紅皮病型、關節型及混合型銀屑病者;不能簽署知情同意書者;孕婦等不符合倫理學要求者。對照組：不能簽署知情同意書。

1.5?剔除標準?①對本研究所用藥物過敏者;②治療過程中，未按要求服藥，或自行服用其他藥物，不能判定療效者;③不配合復查、采集血樣等實驗操作的不合作者;④記錄不全或自動中止治療者;⑤干預過程中出現重大負面事件，如傷病、重大精神刺激者。

1.6?藥物及試劑?加味涼血消風散免煎顆粒，四川省中醫院藥劑科制備;BCA蛋白濃度測定試劑盒，批號：KGP903，南京凱基生物公司;預染蛋白 Marker，批號：00215343，美國 NEB 公司;ECL 發光試劑盒，批號：BL520A，美國 Thermo 公司;PVDF 膜，美國 Hybond 公司;BCL2 抗體，兔單克隆抗體，批號：ab32124;JAK3 抗體，兔多克隆抗體，批號：ab203611;P53 抗體，兔多克隆抗體，批號：ab31333;STAT3 抗體，兔單克隆抗體，批號：ab32500;β-actin 抗體，鼠單克隆抗體，批號：ab8226;生物素化山羊抗鼠 IgG（H+L），批號：ab6789;生物素化山羊抗兔 IgG（H+L），批號：ab6721，均購于英國 abcam--艾博抗（上海）貿易有限公司。

1.7?儀器?垂直電泳槽、DYY-6C 電泳儀、UVTransilluminator化學發光凝膠成像儀、ChemiDoc XRS+ Systems 凝膠掃描成像儀、Image Lab 凝膠分析系統，均購于美國 Bio-RAD 公司;TS-2 水平脫色搖床，海門Kylin-Bell儀器制造有限公司;Thermo 全功能酶標儀，型號：MK3，美國ThermoFisher 儀器有限公司;MDF-U50V 型超低溫冰箱，日本 Sanyo 公司;TGL-16 g-A 型高速低溫離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.8?治療方法及療效判定?治療組口服中藥免煎劑：加味涼血消風散顆粒，組成：水牛角粉30 g，生地20 g，丹皮15 g，連翹15、僵蠶10 g，地骨皮15 g，紫荊皮15 g，冬桑葉5 g，炙甘草3 g，白花蛇舌草30 g，玄參15 g，女貞子15 g，旱蓮草20 g。每日早、中、晚3次，每次1小格，開水沖服。治療周期為8周，每2周復診一次，治療期間不服用及外用其他藥物，皮膚干燥可予白凡士林外用緩解。治療前后按照PASI 評分法及樣本蛋白指標變化評估臨床療效;治療前后檢查患者血常規、肝腎功能評估安全性。

1.8.1?樣本采集?無菌采集對照組及實驗組治療前后清晨空腹外周靜脈血5 mL，置于抗凝管中。

1.8.2?檢測指標?Western blot法檢測血清中JAK3、STAT3、BCL-2、P53的蛋白水平

實驗步驟：①提取細胞總蛋白并定量：將新鮮外周血離心分離白細胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解10 min后離心10 min取上清液;按BCA蛋白定量試劑盒方法進行蛋白定量，繪制標準蛋白曲線，測定樣品蛋白濃度;②SDS-PAGE電泳：放入備好積層膠，加電泳緩沖液后上樣，第1個樣孔中加入5 uL的預染蛋白Marker，據所測蛋白濃度，每孔按蛋白量60 ug上樣，穩定電壓為100 V，15 min，當溴酚蘭染料到分離膠便將電壓調至180 V繼續電泳，達凝膠底部時終??止;③轉膜：卸下分離膠，標記方位，照分離膠尺寸剪1張PVDF膜和6張濾紙，依次以海綿、濾紙（3張）、膜、分離膠、濾紙（3張）、海綿的順序疊放，200 mA轉膜1-2 h;④封閉、抗體孵育：將PVDF膜放入5%BSA封閉液，搖床輕搖2 h，TBST洗膜3次;一抗孵育：加入BCL2、JAK3、P53、STAT3和β-actin一抗4℃過夜，TBST洗膜3次;二抗孵育：加入二抗，室溫輕搖2-3 h，TBST洗膜3次;⑤顯影、圖像分析：將ECL發光液均勻滴加到膜上，反應1 min后去盡殘液，放入化學發光凝膠成像儀的暗室中曝光顯影;將膠片用Image Lab 凝膠分析系統進行掃描分析，結果以目的蛋白相對表達量表示。目的蛋白相對表達量=目的蛋白積分光密度值（IOD）/內參積分光密度值（IOD）。

1.9?統計方法?使用SPSS 17.0進行統計分析。數據以Mean±SD表示，多樣本均數間比較采用One-Way ANOVA檢驗，方差齊則采用LSD檢驗，方差不齊則采用Tamhanes T2檢驗，檢驗結果以P<0.05時認為其組間差異有顯著性。

2?結果

2.1?治療前后PASI評分比較及安全性評價?實驗組治療前PASI評分為16.20±3.90，治療后為7.03±2.62，PASI評分較前明顯下降，t=6.004，P<0.01。治療前后血常規、肝腎功能未見異常，且未有其他不良事件發生。

2.2?蛋白水平

2.2.1?各組蛋白電泳條帶清晰，實驗組與對照組灰度之間有差異?見圖1-圖5。

2.2.2?各組目的蛋白統計結果以OD值表示，見表1。

3?討論

銀屑病難治愈易復發，病因不明，病理改變確切，有學者從角質形成細胞病理改變角度來研究本病，認為表皮KC過度增殖，導致皮膚角化過度，產生銀白色鱗屑[8]。筆者發現KC細胞增殖與細胞凋亡異常有關，抑制KC凋亡從而會出現銀屑病表皮細胞增生的表現[9]。正常情況下，細胞凋亡平衡增殖以維持表皮厚度，有助于角質層的形成，并可消除惡性腫瘤細胞[10]，而銀屑病患者的這種穩態是失衡的，表現為表皮過度增殖和角化不全，角質形成細胞的分化也被看作是另一種形式的凋亡[11]。過度增殖和分化不全意味著凋亡的異常，而細胞凋亡受到諸多凋亡基因及信號通路的影響。

BCL-2、P53是一組調控細胞凋亡的重要基因且參與銀屑病發病。孫軍等[11]認為KC的凋亡過程可被凋亡抑制蛋白阻斷，如BCL-2和IAP家族蛋白Survivin。倪曉等[12]認為BCL-2與原癌基因c-myc 的共表達則能有效地拮抗p53的G1期停滯和細胞凋亡二種作用。崔紅宙等[13]認為銀屑病中p53結構發生了變化，導致p53磷酸化作用減弱或消失，促進銀屑病的發生。研究表明，銀屑病患者外周血淋巴細胞中BCL-2蛋白表達下降、P53表達增加[14]，細胞凋亡異常。

JAK3/STAT3信號通路活化與銀屑病發病、細胞凋亡相關。JAK/STAT通路由JAK激酶和轉錄激活子STAT組成，廣泛參與細胞外信號傳遞：淋巴細胞等分泌的細胞因子與相應受體結合活化酪氨酸激酶JAK，活化的JAK激酶催化STAT，磷酸化的STAT以二聚體的形式進入細胞核內激活或抑制下游靶基因調節元件[15]，從而實現細胞信號內傳。JAK3 是JAK激酶4個亞型之一，主表達于造血細胞和淋巴細胞中[16]，淋巴細胞可以分泌白細胞介素如IL-6、IL-23等，與銀屑病發病相關;目前JAK3靶向抑制劑托法替尼證明對銀屑病有良好治療作用，12周治療后39.5-63.6%實驗銀屑病患者顯示PASI評分至少降低75%[17-18]。STAT3是STAT轉錄激活子7個亞型之一，作為炎癥免疫反應的中心調節子參與銀屑病等炎癥的發病發展[19]。銀屑病時STAT3活化，活化的STAT3通常存在于銀屑病免疫細胞和角質形成細胞中，誘導KC的增殖和異常分化[20-22]，抑制STAT3活化可以促進細胞凋亡[23]。

實驗組加味涼血消風散是四川省名中醫艾儒棣教授治療尋常型銀屑病血熱證的驗方。實驗發現，治療前血熱證患者血清中JAK3/STAT3信號通路有活化，BCL-2明顯升高提示細胞凋亡受到抑制，與之相對的促凋亡P53表達明顯降低，這與Qin JianZhong[24]等研究認為銀屑病皮損區的角質形成細胞表現出凋亡抵抗、P53活性缺乏是一致的，表明KC細胞凋亡減少。經加味涼血消風散干預后，JAK3、STAT3活化水平下調，而P53上調，這與郭彬[25]等研究認為抑制JAK/STAT通路，P53表達水平明顯升高是一致的。證明加味涼血消風散發揮了調控作用，結合PASI評分的改善說明這種調控是有效的治療，且與JAK3/STAT3通路受抑制與P53的促進相關。治后BCL-2、P53與正常人表達仍有差異，猜測與銀屑病復發性有關，將作為后續大樣本驗證的內容。

參考文獻：

[1]李雋，李美紅，玉男，等.銀屑病患者基本特征的地區差異分析[J].中國皮膚性病學雜志，2017，31（1）：31-33.

[2]郝平生.加味涼血消風散治療尋常型進行期血熱證銀屑病30例療效觀察[J].中藥與臨床，2011，2（3）：50-51+58.

[3]郝平生，張婧，朱梅，等.加味涼血消風散對豚鼠銀屑病樣皮損病理及PCNA表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（11）：238-239.

[4]郝平生，張婧，嚴曉萍，等.加味涼血消風散對豚鼠銀屑病樣皮損細胞凋亡和TNFR1的影響[J].中華中醫藥雜志，2016，31（11）：4681-4683.

[5]張學軍，陸洪光，高興華，皮膚性病學.第八版.[M].北京：人民衛生出版社，2013：139-140.

[6]歐陽恒，楊志波.新編中醫皮膚病學.[M]北京：人民軍醫出版社，2000：332～338.

[7]國家中醫藥管理局.中藥新藥臨床研究指導原則.[M]北京：中國醫藥科技出版社，2002：299-302.

[8]李紅，胡晉紅.銀屑病發病機制的免疫學研究進展[J].藥學服務與研究，2012，12（4）：277-279.

[9]Cheryl M.Sweeney，Ann-Marie Tobin，Brian Kirby.Innate immunity in the pathogenesis of psoriasis[J].Archives of Dermatological Research，2011，303（10）：691-705.

[10]Deepak Raj，Douglas E Brash，Douglas Grossman.Keratinocyte apoptosis in epidermal development and disease[J].The Journal of investigative dermatology，2006，126（2）：243-57.

[11]孫軍，胡晉紅.銀屑病角質形成細胞凋亡抑制的機制研究進展[J].藥學服務與研究，2011，11（5）：337-339.

[12]倪曉，孫建方，曾學思，等.c-myc、p53和BCL-2與銀屑病角質形成細胞凋亡異常關系的研究[J].中華皮膚科雜志，2000（4）：26-28.

[13]崔紅宙，張開明，王麗.銀屑病p53通路表觀遺傳機制的研究動態[J].中國中西醫結合皮膚性病學雜志，2010，9（6）：395-397.

[14]彭世光，李娜，藍祖連，等.早幼粒白血病在銀屑病病人外周血淋巴細胞中的表達及其與p53和BCL-2家族的相關性[J].首都醫科大學學報，2017，38（5）：645-649.

[15]Yang Yongsheng，Dong Qiumei，Li Rongheng.Matrine induces the apoptosis of fibroblast-like synoviocytes derived from rats with collagen-induced arthritis by suppressing the activation of the JAK/STAT signaling pathway[J].International journal of molecular medicine，2016，39（2）：307-316.

[16]OShea JJ，Plenge R.JAK and STAT signaling molecules in immunoregulation and immune-mediated disease[J].Immunity，2012，36（4）：542-550.

[17]Bachelez H，M van de Kerkhof PC，Strohal R，et al.Tofacitinib versus etanercept or placebo in moderate-to-severe chronic plaque psoriasis：a phase 3 randomised non-inferiority trial[J].The Lancet，2015，386（9993）：552-561.

[18]Hsu L，Armstrong AW，Wong H.JAK inhibitors：treatment efficacy and safety profile in patients with psoriasis[J].J Immunol Res.2014（2014）：283-617.

[19]Calautti E，Avalle L，Poli V.Psoriasis：A STAT3-Centric View[J].International Journal of Molecular Sciences，2018，19（1）：171.

[20]冉立偉，蘭東，賈紅俠.尋常性銀屑病皮損中STAT3的表達及磷酸化STAT3的水平[J].中國皮膚性病學雜志，2011，25（9）：675-677.

[21]Alves de Medeiros AK，Speeckaert R，Desmet E，et al.JAK3 as an emerging target for topical treatment of inflammatory skin diseases[J].PLoS One，2016.11（10）.

[22]Sano S，Chan KS，Carbajal S，et al.Stat3 links activated keratinocytes and immunocytes required for development of psoriasis in a novel transgenic mouse model[J].Nat Med，2005，11：43-49.

[23]陳元巖，鐘俊新，吳雪松，等.華蟾素對胃癌腫瘤細胞SGC-7901增殖、凋亡以及JAK/STAT3信號通路的影響[J].廣東醫科大學學報，2018，36（2）：152-155.

[24]Qin JianZhong，Chaturvedi V，Denning M F，et al.Regula-tion of apoptosis by p53in UV-irradiated human epidermis，psoriatic plaques and senescent keratinocytes[J].Oncogene，2002，21（19）：2991-3002.

[25]郭彬，郭佳培，李雷雷，等.IL-17-JAK2/STAT3信號通路通過調控p53降低肝癌細胞化療凋亡敏感性的研究[J].重慶醫科大學學報，2017，42（7）：845-849.

（收稿日期：2019-09-20）