補益營衛方對衰老表皮結構蛋白對K4、K13的影響

焦翠琴 王浩 周小平

摘要：目的?觀察補益營衛方對衰老表皮結構蛋白對K4、K13的基因和蛋白表達水平的影響，探討補益營衛方延緩皮膚衰老的機制。方法?消化分離出年輕小鼠和自然衰老小鼠的表皮細胞，并進行傳代培養，其中將自然衰老的小鼠表皮細胞分為2組，1組為常規培養，另1組為用含有2.5%補益營衛方培養基培養，然后采用熒光定量RT-PCR法和Western Blotting法分別檢測細胞K4、K13mRNA表達水平和細胞K4、K13蛋白表達水平。結果?與年輕組比較，老年組的K4、K13mRNA與蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）;經藥物干預后衰老表皮細胞中K4、K13mRNA與蛋白表達水平較老年組均顯著降低（P<0.05）。結論?補益營衛方可通過抑制衰老表皮結構蛋白對K4、K13的表達，起到延緩皮膚衰老的作用。

關鍵詞：補益營衛方;皮膚衰老;角蛋白4;角蛋白13;中醫藥

中圖分類號：R285.5??文獻標志碼：A??文章編號：1007-2349（2019）12-0054-03

皮膚是最早反應機體衰老的外在組織，皮膚衰老不僅影響人們的外在美容，而且還給人們的社交帶來一定的困擾，且在病因學上與許多皮膚病有關聯。皮膚衰老，它是一個復雜的現象，在皮膚老化過程中有一系列生物學的改變，如皮膚和皮下組織細胞成分的減少和免疫系統的改變[1]。目前，預防和延緩皮膚衰老已成為醫學科學研究的熱點之一，有研究發現角質形成細胞在皮膚衰老中發揮重要作用，角蛋白是表皮細胞的結構蛋白，是一類具有支撐和保護功能的纖維狀蛋白質，具有維持細胞分化、參與細胞定位等功能[2]。同時《內經》認為，營衛和諧是人體生命活動賴以發生的基礎，與皮膚生理病理有著十分密切的關系。營衛的盛衰是影響皮膚狀態的重要因素[3]。營衛循行于全身各處，調節著五臟六腑及全身的機能，使人體機能活動正常。因此研究營衛與皮膚衰老的關系具有理論和實踐意義。本實驗研究補益營衛方對衰老表皮結構蛋白對K4和K13的影響，探討補益營衛方延緩皮膚衰老的機制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?實驗藥物?補益營衛方藥由生黃芪15 g，人參5 g，炙甘草7 g組成。購買于寧夏醫科大學附屬回醫中醫門診部，常規水煎2次后合并濾液濃縮成1 g/mL（毫升含1 g生藥），放置4℃冰箱冷藏備用。

1.1.2?實驗動物?選用健康清潔級昆明種雌性小鼠，3月齡（年輕組）10只，重量（20～22 g）;14月齡（老年組）10只，重量（28～31 g）。

1.1.3?主要試劑和儀器?胎牛血清（美國，Gibco 公司）;DMEM（High Glucose）及磷酸鹽緩沖液（BI）;D-Hanks液、中性蛋白酶（北京酷來博科技有限公司）;SW-CJ-1FD 型超凈工作臺（中國蘇潔凈化公司）;MEM—F12 培養基（美國，Gibco 公司）;Trizol試劑（BioFlux公司）;DNase I（TaKaRa公司）;HF-90恒溫CO2培養箱（Thermo Scientific）;CKX41 型倒置相差顯微鏡（日本 OLYM-PUS 公司）;迷你離心機（杭州米歐儀器有限公司）;電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司）;PCR梯度擴增儀（北京索萊寶生物有限公司）、PCR儀（杭州米歐儀器有限公司）等均由寧夏醫科大學解剖實驗室和寧夏醫科大學科技中心提供。

1.2?方法

1.2.1?細胞分離、培養、處理?取年輕組和老年組小鼠背部的皮膚，剪成1 cm×0.5 cm小塊，制備成細胞懸液，按1×105/mL的密度接種在培養皿里，每次換液前后都在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀況。待70%～80%的細胞融合后進行傳代。其中老年組細胞分為2組，一組為常規培養，另一組為用含有2.5%補益營衛方藥物的培養基培養，48h后收集細胞用于指標檢測。

1.2.2?細胞K4、K13mRNA表達檢測?采用熒光定量RT-PCR法。提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。用Primer Premier 5.0軟件設計靶基因K4、K13、內參GAPDH引物序列。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統掃描拍照，計算各樣品的目的基因相對定量結果，即其他各個樣品相對于對照樣品，目的基因mRNA轉錄水平的差異。

1.2.3?細胞K4、K13蛋白表達檢測?采用Western Blotting法。提取總蛋白后電泳、轉膜及封閉;一抗孵育（兔抗人K17抗體滴度為1：1000），增強發光劑顯像，曝光。二抗孵育（羊抗兔IgG抗體滴度為1：2000）1-2 h。以目的蛋白條帶與相應內參GAPDH條帶的灰度值比值作為其蛋白水平的相對表達量。

1.3?統計學方法?采用統計軟件SPSS 21.0進行統計學分析，實驗數據均采用均數±標準差（x±s）表示，多組均數采用單因素方差分析（one-way ANOV-A），組間兩兩比較采用方差分析、LSD檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2?結果

2.1?補益營衛方對衰老小鼠表皮K4、K13mRNA表達的影響?實驗結果見表1。與年輕組比較，老年組K4、K13mRNA表達水平顯著升高（P<0.05）;經2.5%藥物干預后，衰老表皮K4、K13mRNA表達水平較老年組顯著降低（P<0.05），但高于年輕組的水平，提示補益營衛方對衰老小鼠表皮K4、K13m RNA表達水平具有明顯的抑制作用。

2.2?補益營衛方對衰老小鼠表皮K4、K13蛋白水平的表達影響?實驗結果見表2。與年輕組比較，老年組K4、K13蛋白水平表達顯著升高（P<0.05）;經2.5%藥物干預后，衰老表皮K4、K13蛋白水平表達較老年組顯著降低（P<0.05），但高于年輕組的水平，提示補益營衛方對衰老小鼠表皮K4、K13蛋白水平表達具有明顯的抑制作用。

3?討論

在人體器官中，皮膚是最大的器官，它是抵當皮膚受外界侵襲的第一層保護膜，具有防護、代謝、免疫等諸多作用。皮膚衰老也是人體衰老外在最直觀的表現，也是最容易察覺到的。隨著生活水平的提高，人們越來越重視養生保健，以求延年益壽、延緩衰老，近年來大量的相關研究有力地論證了中醫藥在皮膚抗衰方面的一系列作用。中醫學認為營衛二氣關乎人體盛衰，是機體衰老與否的重要因素。同時，就機體全身而言，駐顏防衰也需要調理臟腑氣血的平衡[4]。《難經·三十二難》曰：“心者血，肺者氣，血為營，氣為衛，相隨上下，謂之營衛。”營氣作為血的前體，進入血中成為血的一部分[5]。所以說，一旦營氣虧虛會影響血液的生化，氣血不足就會加速皮膚的衰老。因此，在延緩皮膚衰老時應注重營衛的調和，營氣盛則血盛，營氣衰則血衰，氣血不足就會導致皮膚衰老;此外，衛氣受損，皮膚抵當外邪的能力下降也會受到影響，皮膚也就更加容易受到外界因素的影響，營衛二氣從內外兩個不同方面影響著皮膚衰老的進程。因此，對于皮膚衰老，尤其是防治上，更應注重調理營衛[6]。

為此，導師周小平教授通過經典古籍《傷寒論》和《金匱要略》對營衛相關方劑的進行挖掘、整理和分析，并做進一步研究與探討，認為“營氣不足”是導致身體疼痛的主要病機，從桂枝新加湯證中選取補益營氣的人參，從治虛勞的黃芪建中湯證選取補益衛氣的生黃芪，再將益氣調和諸藥的藥性炙甘草加入其中，組成了補益營衛方。且在前期的研究中發現，補益營衛方藥在亞急性皮膚衰老模型中具有抗脂質過氧化、提高膠原水平和改善衰老皮膚形態學變化的作用[7，8]。因此本實驗從補益營衛的角度再次出發，進一步探討補益營衛方對衰老皮膚表皮中角蛋白K4、K13的表達影響。

角蛋白是中間絲蛋白中最大和最復雜的一組，其中表皮蛋白可以分為兩型：I型角蛋白和II型角蛋白。其中一種I型角蛋白和另一種II型角蛋白形成“角蛋白對”，在一定的組織中特異地表達，特定角蛋白對構成的中間絲具有獨特的物理性質，以適應不同組織對張力強度、柔韌性和動力學的需要。角蛋白在維持整個表皮結構上的完整性起重要作用。根據相關研究表明[9]，K4、K13是一對角蛋白對，它們主要通過黏膜非角化性復層鱗狀上皮的方式進行表達，其表達異常的時候出現相關疾病為白色海綿樣痣（WSN）。

K4屬于Ⅱ型角蛋白，分子量約為54KD，是上皮非角化和分層標志，主要分布在口腔、鼻腔、食道、會陰等黏膜，賦予非角化黏膜以彈性和柔韌性[10]。K4還與上皮不典型增生和癌變有關，口腔白斑（Oral Leukoplakia，OLK）重度不典型增生組織中K4 mRNA水平明顯低于輕中度不典型增生者，口腔鱗狀上皮細胞癌（oral aquamouscell carcinoma，OSCC）組織中K4 mRNA明顯低于白斑患者[11]。而筆者實驗研究發現老年組小鼠較年輕組小鼠的K4蛋白表達量和基因表達水平明顯增高，可以推斷這種表達量的增高可能與不典型增生有關，年齡越大，衰老小鼠的不典型增生越多，說明其皮膚衰老越嚴重，經2.5%的藥物干預治療后老年組小鼠K4的蛋白表達量和基因表達都顯著下降，這說明補益營衛方有抑制皮膚不典型增生的作用，從而達到延緩皮膚衰老的作用。

角蛋白13（K13）屬Ⅰ型角蛋白，相對分子質量54×103。K13是鱗狀上皮細胞轉化及分化的標志[12]。研究發現它與多種鱗狀細胞癌的發生、發展密切相關，包括鼻咽癌、食管癌、宮頸癌、皮膚癌等[13，14]，這些腫瘤中的K13基因多表達異常。目前關于K13表達與腫瘤分化、臨床分期、淋巴轉移的關系，相關文獻報道不盡相同。細胞角蛋白因在組織發生惡變后會出現差異性表達，被廣泛應用于腫瘤的診斷[15]。李超，姜英俊等[16]認為通過誘導Jaridlb過表達的方法，證明了Jaridlb過表達抑制了低分化食管鱗癌細胞KYSE-150增殖并且促進其分化，并且使該細胞中K10和K13的表達水平明顯上升，為食管鱗癌甚至其他鱗癌的治療提供了可能的靶點。在我們的實驗研究中發現，老年組小鼠較年輕組小鼠的K13mRNA表達水平和蛋白表達水平均顯著增高，我們可以推斷出這種增高可能與鱗狀上皮細胞轉化及分化程度有關，年齡越大，其鱗狀上皮細胞轉化及分化程度越高，表明衰老越嚴重，經2.5%的藥物干預治療后我們發現老年組小鼠的K13mRNA表達水平和蛋白表達水平均顯著下降，這說明補益營衛方具有抑制衰老小鼠鱗狀上皮細胞轉化及分化的作用，從而達到延緩皮膚衰老的作用。

因此通過本實驗筆者推測衰老的小鼠上皮萎縮、變薄，造成上皮屏障的損傷，與角蛋白對K4、K13上調引起的細胞骨架受損有關，不典型增生和鱗狀上皮細胞轉化及分化程度增高，使上皮細胞增生、轉化及分化能力受到影響，上皮更新能力受到抑制，這充分表明其異常表達可能是鱗狀上皮細胞轉化和分化增多，引起衰老皮膚粗糙，機械屏障功能下降的原因之一，經補益營衛方干預后，衰老小鼠表皮細胞的K4、K13mRNA表達水平和蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。說明補益營衛方能夠通過降低角蛋白對K4、K13mRNA和蛋白的表達，減少鱗狀上皮細胞轉化和分化，調節表皮蛋白對K4、K13的表達，具有維持表皮結構蛋白表達水平穩定，延緩皮膚衰老的作用。

綜上所述，可以得出補益營衛方通過有效抑制衰老皮膚表皮中角蛋白對K4、K13基因和蛋白表達水平，從而達到延緩皮膚衰老的作用。

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（收稿日期：2019-08-15）