免疫佐劑的復合化研究進展①

樊 凡 方 成

(武漢輕工大學生物與制藥工程學院，武漢430023)

近年報道7種新型佐劑被批準用于人用疫苗：病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)、基于角鯊烯乳劑(MF59)、咪喹莫特(Imiquimod)、雷西莫特(Resiquimod)、AS01(AS，Adjuvant system)、AS03和AS04，其中復合佐劑的占比接近一半，復合化已成為佐劑發展的一大趨勢[1]。現對復合佐劑的研究現狀做一綜述。

1 以鋁鹽為載體的復合佐劑

鋁鹽佐劑作為世界上首次批準的人用疫苗佐劑，已使用了90年[2]。鋁鹽具有較大的表面積和較高的電荷密度，可將抗原吸附在表面。雖然鋁鹽可提高疫苗的抗體滴度，但沒有證據表明可增強細胞免疫。而增強細胞免疫應答對多種疾病的防疫十分必要。因此將細胞免疫刺激物吸附在鋁鹽上是復合佐劑的重要策略。

1.1鋁鹽+Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)配體[單磷酰脂質A(Monophosphoryl lipid A，MPL)] 2009年美國批準的人類乳頭狀瘤病毒16/18(Human papillomavirus-16/18，HPV-16/18)疫苗以AS04為佐劑，它是由TLR4配體MPL吸附于氫氧化鋁構成。AS04較鋁鹽可以誘導更高水平的HPV特異性抗體和記憶B細胞[3]。AS04在注射部位短暫激活轉錄因子NF-κB[4]，誘導IL-2和IFN-γ的產生[1]。在24 h內，AS04直接觸發樹突狀細胞和單核細胞提呈抗原并向淋巴結轉移[5]。AS04對抗原提呈細胞(Antigen presenting cell，APC)快速而短暫的刺激使其能夠處理高濃度抗原[6]。AS04也被用于乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)疫苗[7]。將TLR4配體脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)加入以鋁為基礎佐劑的破傷風類毒素疫苗，發現LPS增加了IgG1和IgG2a抗體的產生，同時減少TH2型免疫反應，但TLR4配體MPL降低TH2反應的效果較弱[8]。

1.2鋁鹽+TLR4配體(CIA05) CIA05是一種來源于LPS突變體的TLR4激動劑，被證明使小鼠脾細胞增強表達抗HBV表面抗原的抗體和IFN-γ[9]。它與鋁鹽合用可增加血清中抗炭疽保護性抗原抗體和毒素中和抗體的滴度[10]。CIA05和鋁鹽按1∶50的比例組成的復合佐劑稱為CIA06，以其為佐劑的HPV疫苗誘導的抗原特異性IgG抗體滴度、脾IFN-γ的分泌和記憶B細胞在免疫后24周仍然保持高水平[11]。

1.3鋁鹽+TLR9配體[CpG寡脫氧核苷酸(Oligodeoxynucleotide，ODN)] CpG ODN是在細菌基因組中發現的可被TLR9識別的核苷酸序列。B類CpG ODN可強烈刺激人B細胞和單核細胞的成熟，而被用于疫苗佐劑[12]。CpG+鋁鹽的組合用于HBV疫苗、炭疽疫苗和流感疫苗，縮短了保護性水平抗體產生的時間并且升高抗體滴度，誘導IFN-γ表達，激活Th1細胞免疫應答[13-15]。還能減少疫苗劑量，且CpG+鋁鹽的組合具有良好的耐受性。CpG和鋁鹽與丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)重組抗原聯用，可通過增加漿細胞的數量，提高免疫反應的效率，增強小鼠的體液免疫[16]。Tian等[17]發現將抗原與鋁鹽-CpG-天然免疫調節肽(Innate defense regulator peptide，IDR)-HH2組合佐劑共同施用明顯激活NK細胞毒性，誘導抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，顯著引發細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)應答，并增加腫瘤中的浸潤淋巴細胞，有效抑制腫瘤生長并減少腫瘤負荷。Mirotti等[18]發現在卵清蛋白致過敏性肺炎模型中，鋁鹽/CpG具通過MyD88和IL-10改變鋁佐劑所誘發的單一TH2型應答，導致平衡的TH1/TH2型免疫反應。

1.4鋁鹽+TLR7/8配體(3M-052) 磷酸基或陰離子電荷可促進對氫氧化鋁的吸附，與TLR4配體(通常含有磷酸基)或TLR9配體(帶負電荷)相比，其他的模式識別受體(Pattern recognition receptor，PRR)配體比如TLR7/8激動劑Imiquimod不包含這種促進吸附的結構。對于不溶性脂質PRR配體來說，處理更加復雜，必須在與鋁鹽進行吸附之前，先將其配制成水懸液。Vasilakos等[19]開發了一種不溶性的合成TLR4配體—葡萄糖脂質A(Glucopyranosyl lipid A，GLA)的水納米懸浮體(Aqueous formulation，AF)GLA-AF，并與磷脂酰膽堿結合，其通過磷酸配體交換來吸附氫氧化鋁。Cortez 等[20]也通過用磷酸鹽化學修飾TLR7激動劑苯并萘啶，使其可吸附于鋁鹽。

Fox等[21]提出了一種假設：輔助脂質可以促進不溶性PRR配體對氫氧化鋁的吸附。即使PRR配體不含磷酸鹽或其他陰離子基團，并用3M-052-AF(TLR7/8配體3M-052和輔助脂質二甲酰甘油酯的水納米懸浮液)和鋁鹽聯合肺結核抗原或HIV抗原，證明可以增強抗體水平和TH1型細胞免疫。

2 以乳劑為載體的復合佐劑

PELC是一種新型的納米乳劑，由生物可吸收的聚合物PEG-b-PLACL、Span85和角鯊烯組成[22]。Huang等[23]證明了PELC在模擬體內環境可降解并具耐受性，所荷載的抗原在基質中持續釋放，誘導高濃度的特異性抗體的產生，并極大地增強抗原特異性T細胞應答。此外，PELC不僅將APC募集到注射部位，而且還誘導募集的APC活化并遷移到引流淋巴結。Chen等[24]發現相比于鋁劑，PELC/CpG能使重組H7HA(rH7HA)亞單位疫苗引發更高的病毒中和抗體表達，并且在脾中誘導更多的H7HA特異性IFN-γ分泌性T細胞和抗體分泌細胞，提高機體對H7N9型禽流感病毒的免疫能力。PELC/CpG佐劑還可用于一種新的腫瘤相關抗原L6的B細胞表位及CTL、TH表位嵌合長肽的配制，這種合成肽可應用于癌癥免疫治療[25]。

此外一種新型的O/W納米乳劑(Nanoemul-sion，NE)W805EC，由大豆油(64%)和十六烷基吡啶(1%)、吐溫80(5%)和乙醇(8%)在水中高速乳化制成，且平均粒徑為350 nm。NE是一種新型黏膜佐劑，可誘導強大的IgA和IgG抗體反應以及特有的TH1/TH17細胞免疫。在基因敲除的小鼠中發現其可能同時通過TLR依賴和非依賴性的途徑來誘導適應性體液和細胞免疫[26]。Bielinska等[27]通過用鋁佐劑使乙肝表面抗原在小鼠肌肉內免疫建立TH2免疫應答，隨后用NE-乙肝表面抗原免疫一次，發現 TH1相關免疫應答和IL-17表達增多，TH2細胞因子(IL-4和IL-5)和IgG1降低。NE免疫誘導調節性T細胞和IL-10，且IL-10是抑制TH2免疫的。這表明基于NE的疫苗可以降低已有的TH2免疫應答并促進TH1/TH17免疫應答。

3 以脂質體為載體的復合佐劑

脂質體是由膽固醇和磷脂組成的單個或多個雙分子膜囊，無免疫刺激作用和毒性，可被生物降解。抗原可鑲嵌在膜表面或包裹在膜內，發揮倉庫效應和靶向作用。免疫增強性重組流感病毒體(Immunopotentiating reconstituted influenza virosomes,IRIV)由70%的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺(構成磷脂雙分子層)和30%的提純于流感病毒中的糖蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)、神經氨酸酶(Neuramini-dase，NA)(插在磷脂膜表面)組成[28]。HA與巨噬細胞的唾液酸受體結合，介導抗原進入由HA觸發膜融合巨噬細胞的細胞質，NA可降低宿主黏液的黏性，使抗原更易接近宿主上皮細胞[29]。IRIV已經應用于流感疫苗和甲型肝炎疫苗中，甲肝抗原經純化、滅活后結合在IRIV磷脂膜表面。

免疫刺激復合物是由皂苷、膽固醇、磷脂組成的直徑約30～40 nm的脂質小泡，可促進抗原的呈遞，增加抗體滴度的同時誘導細胞免疫應答，現已用于多種疫苗如 HIV疫苗、流感疫苗等[30]。Fox等[31]通過將TLR7的配體Imiquimod置于脂質體內部，將TLR4配體GLA插入脂質雙層，發現與只含有一種TLR激動劑相比，在脂質中組合兩種激動劑更易引發TH1型免疫且穩定期提升至一年以上。

4 非載體佐劑的復合化

4.1TLR7/8配體(3M-052)+TLR9配體(CpG ODN) TLR7/8激動劑3M-052和TLR9激動劑CpG ODN都可觸發天然免疫反應，繼而誘發腫瘤特異性免疫[32,33]。之前的研究表明這些激動劑單獨使用可以提高小腫瘤患者的存活率但對大/晚期腫瘤的治療效果有限。Zhao等[34]使實驗鼠荷同種基因腫瘤，在腫瘤達到500～800 mm3之后，分別在瘤內注射3M-052、CpG ODN和CpG ODN+3M-052，并對抗腫瘤免疫和腫瘤生長進行了評價。發現聯合使用時導致腫瘤浸潤CTL和NK細胞的募集增加，減少髓系抑制性細胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC)的數量，并顯著減小腫瘤體積，同時提供長期保護防止腫瘤再生。

4.2TLR9配體(CpG ODN)+TLR3配體[poly(I∶C)] Whitmore等[35]最早驗證了poly(I∶C)與CpG ODN合用可以增強對天然免疫細胞的刺激；通過誘導一氧化氮的產生及誘導型一氧化氮合酶、IL-1β、IL-6、IL-8和巨噬細胞炎癥蛋白的表達，在雞單核細胞中誘導比單獨使用poly(I∶C)或CpG ODN時更強烈且持續時間更長的促炎反應[36]。將poly(I∶C) 與CpG ODN聯合用于癌癥治療時，應交替而非同時使用，因為CpG的硫代磷酸酯修飾作用會阻斷poly(I∶C)進入腫瘤細胞[37]。混合佐劑CpG ODN+poly(I∶C)增強了東部馬腦炎病毒DNA疫苗的免疫原性，并在接種的小鼠中顯著增強IL-2、IL-4和IFN-γ高水平分泌的CD4+T細胞應答，也增強CD8+T細胞對IL-2和IFN-γ的反應[38]。

4.3TLR4配體(MPL)+ T細胞共刺激分子(Streptavidin-4-IBB ligand，SA-4-1BBL) 基于腫瘤相關抗原的疫苗由于其免疫原性弱以及在晚期腫瘤中各種活躍的免疫逃避機制，其治療效果有限。Srivastava等[39]聯合應用兩種不同類型的佐劑SA-4-1BBL和MPL，將它們不同的免疫細胞靶點、信號通路以及活化細胞免疫反應的作用相結合，發現在無毒性的情況下，疫苗在實驗模型中可根除腫瘤。SA-4-1BBL/MPL佐劑組合的效應與活化樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)、增加CD8+T細胞在腫瘤中的浸潤、顯著減少CD4+CD25+Foxp3+T調節細胞有關。進一步的研究發現，組合佐劑中的MPL與DC上的TLR4結合使其活化，上調共刺激受體/配體和各種促炎因子如IL-12、IL-16和IFN-γ，從而啟動適應性T細胞免疫應答。SA-4-1BBL通過與DC上的受體結合活化DC、克服T調節細胞介導的免疫抑制來增強MPL的作用，與CD8+T細胞上的受體結合可使其增殖、分化、轉化為致敏T細胞，并建立長期記憶[40]。

5 展望

佐劑的復合化可以在提高抗原免疫原性、免疫應答強度、免疫記憶以及減少免疫耐受等方面發揮更好的效果，同時利于控制副作用。尤其腫瘤疫苗的發展面臨著兩大障礙：免疫抑制和抗原性差，復合佐劑應用于腫瘤疫苗是最有希望規避這些障礙的方法[41]。新型佐劑組合可以通過激活多種免疫細胞和免疫機制，產生協同效應來增強免疫應答。