TRAF-6調控TGF-β1-Smad2/Smad3信號通路在Graves病免疫發病機制中的作用①

譚 燕 鄭曉雅 李 莎 劉 純

(重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌科，重慶400016)

Graves 病(Graves′ disease,GD)是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病，可釋放過量甲狀腺激素而導致甲狀腺功能亢進，進而引起多器官損害。目前，GD的發病機制尚不完全清楚。Th17細胞是一種新發現的CD4+T細胞亞群，能夠分泌白介素-17A/F(Interleukine-17A/F,IL-17A/F)等多種效應細胞因子[1]。前期研究發現Th17細胞及其效應因子IL-17參與GD的發病過程[2]。維甲酸相關孤兒受體γt(Retinoid-related orphan receptor gamma t,RORγt) 是Th17細胞的特異性轉錄因子，誘導Th17細胞的分化和IL-17的表達。Treg細胞是CD4+T細胞的另一種細胞亞型，可以直接發揮免疫抑制作用，也可以通過分泌調節免疫的IL-10、轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)抑制細胞免疫[3-7]。Treg細胞及其分泌的細胞因子在GD的發病過程中發揮免疫抑制的作用[8]。叉頭蛋白P3(Forkhead box protein p3,Foxp3)是Treg細胞的特異性轉錄因子，控制Treg細胞的發育和功能。Th17細胞和Treg細胞的分化相互抑制，功能相互調節，在機體正常狀況下保持平衡，而Th17/Treg細胞失衡參與多種自身免疫性疾病的發生[9,10]，包括 GD[8]。然而，Th17/Treg細胞平衡的上游調控機制仍不清楚，有待進一步研究。研究發現，IL-2可作為分化信號誘導初始CD4+T細胞向Treg細胞分化，同時抑制Th17細胞的分化，進而調控Th17/Treg細胞平衡[11-15]。耿明霞等[16]的研究發現，IL-2在GD中表達降低，參與GD的發生過程。因此，IL-2可能通過調控Th17/Treg細胞平衡，進而阻礙GD的發生。IL-2的表達在各個水平上都受到精密調控，過高或過低均會引起機體免疫功能紊亂。

近來研究表明，除了介導免疫炎癥，腫瘤壞死因子受體相關因子-6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF-6)在維持免疫耐受方面也具有重要意義[17-19]。新近研究發現，TRAF-6可能通過阻礙TGF-β介導的Smad2/Smad3磷酸化而上調IL-2的表達，進而抑制Th17細胞的分化，控制炎癥的發生，發揮免疫耐受的作用[20]。同時，TRAF-6在維持Treg細胞的擴增和穩定性中發揮關鍵作用，并參與免疫耐受[21]。此外，TGF-β1在免疫系統中發揮重要作用，參與機體免疫調節[22]。因此，TRAF-6可能通過下調TGF-β1介導的Smad2/Smad3磷酸化，解除對IL-2表達的抑制，進而調控效應T細胞的分化，參與維持免疫耐受。前期研究發現，GD患者的外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中TRAF-6的mRNA和蛋白的表達較對照組減少，且差異具有統計學意義[23]，提示TRAF-6可能通過發揮免疫耐受的作用，參與GD的發病。然而，在GD的發病過程中，TRAF-6是否發揮免疫耐受的作用及其具體的作用機制目前尚不清楚。因此，本研究旨在探索TRAF-6是否通過影響TGF-β1-Smad2/Smad3的磷酸化，解除對IL-2表達的抑制，調控Th17/Treg細胞的分化平衡，進而在GD的發生中發揮免疫耐受的作用。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 收集2016年11月至2017年6月在重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌科就診的GD病患者和參加體檢的健康人，將志愿者分為初診GD組、甲狀腺功能恢復正常的GD(eGD)組和對照組(NC)。根據2008年《中國甲狀腺疾病診治指南》[24]，初診GD組納入標準：首次診斷為 GD 且未服用任何抗甲狀腺藥物的患者，伴有甲狀腺功能亢進的癥狀和體征;均有不同程度彌漫性甲狀腺腫大；血漿游離三碘甲狀腺原氨酸(Free triiodothyronine,FT3)或游離甲狀腺激素(Free thyroxine,FT4)升高及敏感促甲狀腺激素(Ultra-sensitive thyroid stimulat-ing hormono,uTSH)降低;血漿抗促甲狀腺素受體抗體(Thyrotrophin receptor antibody，TRAb)呈不同程度陽性。 GD組共30例患者，其中23例女性，7例男性。eGD組納入標準：既往明確診斷為 GD 的患者，經抗甲狀腺藥物治療時間≥1 年且甲狀腺功能恢復正常，現甲巰咪唑(賽治) 維持治療劑量5～10 mg/d的GD患者。eGD組共30例患者，其中19例女性，11例男性。NC組納入標準：性別及年齡匹配的健康人。NC組共28例，其中16例女性，12例男性。所有入選對象均需排除患有1型糖尿病、系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、自身免疫性肝炎等常見的自身免疫性疾病、急性感染及慢性炎癥性疾病等且過敏、妊娠、長期口服任何非甾體類或糖皮質激素類藥物的患者。

1.1.2實驗材料 人淋巴細胞分離液(天津TBD生物技術發展中心，中國)；RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒 (TaKaRa，日本)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE配制凝膠試劑盒(碧云天，中國)；預染蛋白Marker Ladder(Thermo，美國)；磷酸酶抑制劑(Roche，美國)；ECL試劑盒(Advansta，美國)；兔抗人β-actin、兔抗人TRAF-6、兔抗人Smad2/Smad3、兔抗人磷酸化Smad2、兔抗人磷酸化Smad3抗體(CST，美國)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司，中國)；脫脂奶粉(Bio-Rad，美國)；PVDF膜(Millipore，美國)；人IL-17、人IL-10、人IL-2、人TGF-β1 ELISA試劑盒(USCN，美國);甲狀腺功能、甲狀腺自身抗體試劑盒(貝克曼庫爾特,美國)和檢測儀器(Beckman Coulter UniCel DxI 800)；熒光定量PCR儀(CFX 96 Real-Time System，Bio-Rad，美國)。

1.2方法

1.2.1樣本采集 采集研究對象靜脈血12 ml于EDTA抗凝真空采血管內，其中2 ml靜脈血用于檢測甲狀腺功能和甲狀腺自身抗體，余下10 ml靜脈血用于PBMCs的提取。

1.2.2甲狀腺功能和甲狀腺自身抗體的檢測 甲狀腺功能(FT3,FT4,uTSH)以及自身抗體包括甲狀腺球蛋白抗體(Thyroglobulin antibody,TGAb),甲狀腺過氧化物酶抗體(Thyroid peroxidase antibody,TPOAb)和TRAb檢測采用美國貝克曼庫爾特測定儀及其試劑，利用化學發光免疫分析法，由本科室專職實驗人員完成。甲狀腺功能及其自身抗體的參考值：FT3為2.5～3.9 pg/ml；FT4為0.61～1.12 ng/dl；uTSH為0.35～3.5 uU/ml；TPOAb為0～9 U/ml；TGAb為0～4 U/ml；TRAb為0.3～1.8 U/L。

1.2.3PBMCs的分離 采用 Ficoll密度梯度離心法，分離的總PBMCs中將三分之一細胞(約3×106～4×106) 用于RNA提取，余下約三分之二PBMCs(約6×106～8×106)用于總蛋白提取。

1.2.4總RNA的提取和熒光定量RT-PCR法測定RORγt、Foxp3、IL-2和TRAF-6 mRNA的表達 細胞總RNA的提取按照RNAiso Plus的說明書進行。cDNA 按照 Prime-ScriptTMRT reagent Kit 的說明書進行逆轉錄合成。RORγt、Foxp3、IL-2和TRAF-6 mRNA的引物序列見表1。熒光定量 PCR反應條件為95℃、30 s；95℃、5 s,60℃、30 s，重復 40個循環。反應體系：cDNA 1.0 μl，上游引物0.4 μl，下游引物 0.4 μl，SYBE GREEN 5.0 μl，DEPC水3.2 μl。以NC組作對照，計算各組RORγt、Foxp3、IL-2和TRAF-6 mRNA的2-ΔΔCt，獲取各組目的基因的相對表達量。

1.2.5ELISA 法測定 IL-17A、IL-10、IL-2、TGF-β1的表達 取患者和健康人血清，ELISA法測定IL-17A、IL-10、IL-2、TGF-β1的表達，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.2.6Western blot測定總Smad2/Smad3、p-Smad2/Smad3和TRAF-6蛋白的表達 以細胞裂解液提取細胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，等量的蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜，電轉移至 PVDF 膜。TBST 洗膜 3次，每次5 min，脫脂奶粉常溫封閉4 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入兔抗人 p-Smad2單抗(1∶1 000)、兔抗人 p-Smad3單抗(1∶1 000)、兔抗人Smad2/Smad3單抗(1∶1 000)、兔抗人 TRAF-6單抗(1∶1 000)、兔抗人β-actin單抗(1∶ 3 000) ，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，將膜放入相應的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000) ，室溫孵育 1 h，TBST沖洗后，ECL法顯色。Fusion凝膠成像系統掃描，并分析各陽性條帶的吸光度值，設內參β-actin作為對照，目標蛋白的相對含量以目標蛋白/β-actin 比值來表示。

表1 RORγt、Foxp3、IL-2、TRAF-6、β-actin mRNA的引物序列

Tab.1 Primer sequences for RORγt，Foxp3，IL-2，TRAF-6，β-actin mRNA

PrimersSequencesbpRORγtF 5′GTGCTGGTTAGGATGTGCCG3′143R 5′GCAATCTCATCCTCGGAAAAGT3′Foxp3F 5′AGAAGGGCAGGGCACAATG3′151R 5′TCGGATGATGCCACAGATGAA3′IL-2F 5′GATGAACTTGGACCTCTGCGG3′184R 5′ATCTCCTCAGAAAGTCCACCACA3′TRAF-6F 5′GGATTCTACACTGGCAAACCCG3′137R 5′CCAAGGGAGGTGGCTGTCATA3′β-actinF 5′CCACGAAACTACCTTCAACTCC3′132R 5′GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT3′

2 結果

2.1甲狀腺功能和甲狀腺自身抗體的表達水平 三組甲狀腺功能和甲狀腺自身抗體的表達水平見表2。

2.2三組RORγt、Foxp3、IL-2、TRAF-6的mRNA表達水平 與NC組相比，GD組中RORγt mRNA 的表達水平升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與NC組相比，GD組中Foxp3和IL-2 mRNA表達水平降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；但RORγt、Foxp3、IL-2 mRNA表達水平在GD組和eGD組之間、eGD組和NC組之間差異均無統計學意義(P>0.05)；GD組中TRAF-6 mRNA的表達水平與eGD組、NC組相比降低，差異均有統計學意義(P<0.05),但eGD組和NC組之間水平表達差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

2.3三組細胞因子IL-17A、IL-10、IL-2、TGF-β1的表達 GD組中IL-17A蛋白的表達水平較NC組增高，且差異有統計學意義(P<0.05)；IL-10、IL-2和TGF-β1蛋白的表達水平較NC組降低，且差異有統計學意義(P<0.05)；但這些差異在GD組和eGD組之間、eGD組和NC組之間均無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.4PBMCs中p-Smad2/Smad3、TRAF-6蛋白的表達 GD組中p-Smad2/Smad3的蛋白表達水平均高于NC組，但差異無統計學意義(P>0.05),而GD組中TRAF-6蛋白的表達水平有一定的下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；這些差異在GD組與eGD組之間、eGD組和NC組之間也均無統計學意義(P>0.05)，見圖3、4。

2.5相關性分析 GD組中，IL-2 mRNA與IL-17A蛋白之間的表達水平正相關(r=0.423,P=0.020)，IL-2 mRNA分別與RORγt mRNA、Foxp3 mRNA、IL-10蛋白之間的表達水平均不相關(r=0.098,P=0.618;r=-0.177,P=0.351;r=-0.031,P=0.872)。IL-2蛋白分別與RORγt mRNA、IL-17A蛋白、Foxp3 mRNA、IL-10蛋白之間的表達水平均不相關(r=-0.122,P=0.535;r=-0.199,P=0.291;r=0.090,P=0.635;r=0.180,P=0.342)。GD組中p-Smad2蛋白與IL-2 mRNA之間的表達水平負相關(r=-0.631,P=0.000)，p-Smad2蛋白與IL-2 蛋白之間的表達水平不相關(r=-0.217,P=0.249)。GD組中p-Smad3蛋白分別與IL-2 mRNA、IL-2蛋白之間的表達水平不相關(r=-0.250,P=0.183;r=-0.210,P=0.266)。GD組中，TRAF-6 mRNA分別與p-Smad2蛋白、p-Smad3蛋白之間的表達水平不相關(r=-0.275,P=0.141;r=-0.216,P=0.251)。TRAF-6 蛋白與p-Smad2蛋白之間表達水平正相關(r=0.382,P=0.037)，TRAF-6蛋白與p-Smad3蛋白之間的表達水平不相關(r=0.108,P=0.570)，見圖5。

GDeGDNCPn(M/F)7/2311/1912/160.278Age(years)34.67±11.62 37.93±11.0939.61±12.440.266FT3(pg/ml)8.02±5.571)2)3.59±1.633.58±0.340.000FT4(ng/dl)3.11±1.471)2)0.86±0.560.80±0.100.000uTSH(uU/ml)0.08±0.241)2)2.99±2.322.09±1.000.000TRAb (U/L)14.18±11.581)2) 4.44±10.291)0.54±0.330.000TPOAb(U/ml)184.67±318.431) 99.15±240.311)1.99±2.010.000TGAb(U/ml)77.51±88.671)2) 17.61±22.721)0.22±0.180.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with eGD group,2)P<0.05.

圖1 三組RORγt、Foxp3、IL-2、TRAF-6 mRNA的表達水平Fig.1 mRNA expression of RORγt,Foxp3,IL-2 and TRAF-6 in three groupsNote: Compared with NC group,*.P<0.05;compared with eGD group,#.P<0.05.

圖2 三組細胞因子IL-17A、IL-10、IL-2、TGF-β1的表達水平Fig.2 Expression of IL-17A，IL-10，IL-2 and TGF-β1 in three groupsNote: Compared with NC group,*.P<0.05.

圖3 三組中p-Smad2/Smad3、總Smad2/Smad3、TRAF-6蛋白的表達Fig.3 Protein expression of p-Smad2/Smad3,total Smad2/Smad3 and TRAF-6 detected by West-ern blot

圖4 定量分析p-Smad2/Smad3和TRAF-6蛋白在PBMCs中的表達Fig.4 Quantitative analysis of p-Smad2/Smad3 and TRAF-6 expression in PBMCsNote: Compared with NC group,*.P>0.05.

圖5 GD患者相關指標的相關性分析Fig.5 Correlation between relevant indicators in Graves′ disease patientsNote: A-D.Correlation between IL-2 mRNA and RORγt mRNA,Foxp3 mRNA,IL-17A protein,IL-10 protein;E-H.Correlation between IL-2 protein and RORγt mRNA,Foxp3 mRNA,IL-17A protein,IL-10 protein;I-J.Correlation between p-Smad2 protein and IL-2 mRNA,IL-2 protein;K-L.Correlation between p-Smad3 protein and IL-2 mRNA,IL-2 protein;M-N.Correlation between TRAF-6 mRNA and p-Smad2 protein,p-Smad3 protein;O-P.Correlation between TRAF-6 protein and p-Smad2 protein,p-Smad3 protein.

3 討論

GD的發病與效應性T細胞分化失衡有關，本研究旨在探討效應T細胞分化失衡的上游免疫耐受調控機制。研究發現Th17細胞和Treg細胞均在GD的發生過程中發揮重要作用[2,8]，在本實驗中，GD組的RORγt mRNA和IL-17A蛋白的表達均較NC組增加。這與前期研究實驗結果一致[2]，提示Th17細胞的表達增加可能促進GD的發病。同時，GD組的Foxp3 mRNA和IL-10蛋白的表達均較NC組減少，提示Treg細胞的表達減少可能誘發GD的發生。這與楊渝等[25]的研究結果趨勢一致。因此，Th17/Treg細胞平衡破環可能導致GD的發病。但調控Th17細胞、Treg細胞分化和功能的上游具體機制仍不完全清楚。

研究表明，IL-2作為分化信號作用于初始CD4+T細胞后，能通過STAT5信號通路抑制RORγt的表達和Th17細胞的分化，同時能促進Foxp3的表達和Treg細胞的分化[11-15,26]，進而調控Th17/Treg細胞平衡。在本實驗中，IL-2的mRNA和蛋白表達較NC組均減少，這與謝克儉等[27]的實驗結果一致，提示IL-2的低表達可能促進GD的發病，但他們的研究僅探討了IL-2表達降低與GD發生的關系，我們的研究探討了IL-2通過調控Th17/Treg細胞分化平衡，進而參與GD的發病。以上研究結果充分說明了在GD的發生發展過程中，IL-2的低表達可能無法有效激活STAT5信號通路，導致RORγt 和Th17細胞的表達增加，分泌更多的IL-17效應炎癥因子，同時抑制Foxp3和Treg細胞的表達，使免疫調節因子IL-10的表達減少，進而引起Th17/Treg細胞失衡。但是，如何導致IL-2的表達減少，進而引起Th17/Treg細胞失衡的免疫過程仍不清楚。

在本實驗中，GD組的p-Smad2/Smad3蛋白表達較NC組雖然差異均沒有統計學意義，但都展示出增加的趨勢，這提示高表達的p-Smad2/Smad3蛋白可能導致GD的發生，而GD組與NC組之間蛋白表達的差異不具統計學意義，可能是由于GD中TGF-β1的表達減少，導致Smad2/Smad3磷酸化水平降低。GD組的TGF-β1表達較正常組更低，提示TGF-β1的異常表達可能參與GD的發生。這與王建國等[28]的實驗結果一致，而與李紅林等[29]的實驗結果趨勢相反。這可能由于本研究和李紅林的實驗所選實驗對象群體不一致，或患者所處疾病發展階段不一致。而GD組中TGF-β1的表達降低，可能是由于在GD的發生過程中，機體為維持免疫平衡進行自我調節，通過降低TGF-β1的表達來減少TGF-β1-p-Smad2/3途徑誘導的Th17細胞分化。同時，GD組中TRAF-6的mRNA表達較NC組降低，差異有統計學意義，而GD組中的TRAF-6的蛋白表達較NC組有下降的趨勢，但差異無統計學意義，這與前期研究結果趨勢一致[23]，提示低表達的TRAF-6可能促發GD。

在對GD組的數據進行相關性分析時，我們發現，p-Smad2蛋白與IL-2 mRNA之間的表達水平負相關，提示p-Smad2對IL-2表達的調控可能在GD的發生過程中發揮作用；然而其余相關性分析結果與本研究假設不相符，可能是由于本研究收集的樣本量太少，這提示要深入探討在GD的發生過程中，TRAF-6通過影響TGF-β1介導的Smad2/Smad3蛋白磷酸化，維持IL-2對Th17/Treg細胞平衡的調控作用，我們需要大量的樣本進行驗證。綜上所述，GD患者中TRAF-6的低表達，可能不足以抑制TGF-β1介導的Smad2/3磷酸化，導致增多的Smad2/3磷酸化蛋白下調IL-2表達，進而誘導Th17細胞的分化，同時抑制Treg細胞的分化，使得機體不能維持免疫耐受，促進GD的發生。

然而，TRAF-6抑制TGF-β1介導的Smad2/Smad3磷酸化過程的具體途徑目前尚無報道。研究發現，CD4+T細胞中，TGF-β通過跨膜絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)激酶受體家族轉導信號，該家族主要通過Ⅰ型(TβRⅠ)、Ⅱ(TβRⅡ)型受體傳導信號[30]。TGF-β先結合至TβRⅡ的胞外端,其胞內段的Ser/Thr激酶被活化,使 TβRⅠ因甘氨酸(Gly)-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser結構域磷酸化而活化[31]，磷酸化的TβRⅠ引起下游轉錄因子Smad2和Smad3的磷酸化，而磷酸化的Smad2和Smad3與Smad4協同將信號轉導至細胞核[32-34]，進而調控下游基因，包括IL-2的轉錄。因此，TRAF-6可能抑制TGF-β1結合至TβRⅡ的胞外端、阻礙胞內段的 Ser/Thr 激酶活化、抑制TβRⅠ的活化、阻礙磷酸化的TβRⅠ對Smad2和Smad3進化磷酸化，進而減少TGF-β1介導的Smad2/Smad3的磷酸化。然而，TRAF-6抑制TGF-β1介導的Smad2/Smad3的磷酸化過程的具體途徑有待進一步探究。本實驗結果顯示的三組間甲狀腺功能和甲狀腺自身抗體水平變化，可能是由于eGD病人經過藥物治療后免疫炎癥狀態有所緩解，但還未達到正常人水平，也提示TRAF-6調控TGF-β1介導的Smad2/3磷酸化，進而調控Th17/Treg細胞平衡的機制在GD的發病過程中與免疫狀態有關，而不依賴于甲狀腺。

本研究探討了GD中TRAF-6的免疫耐受作用及其可能的具體作用機制，為效應T細胞失衡的上游機制提供了新角度和新靶點，同時提供了GD免疫發病機制的新方向和針對GD發病機制的診斷與治療的新靶點。