高壓氧對大鼠脊髓損傷后蛋白激酶R樣內質網激酶表達和運動功能的影響①

應新旺，陳曉龍，谷鵬鵬，李思思，蔣松鶴

溫州醫科大學附屬第二醫院康復醫學中心，浙江溫州市325027

蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)是在內質網膜上的一個Ⅰ型跨膜蛋白，屬于真核細胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)上游激酶家族[1]。PERK是介導內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)整合調控反應重要的細胞內信號途徑之一，參與機體多種疾病和病理過程的發生和發展[2]。相關研究表明，適度的ERS可以保護細胞器，持續、劇烈的內質網應激可誘導PERK蛋白表達，最終導致細胞凋亡[3-5]。急性脊髓損傷后，ERS程度明顯增強，上調ERS凋亡相關蛋白，從而引發神經細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞等凋亡[6-7]。而高壓氧作為一種無創的物理治療方法，臨床上已用于治療脊髓損傷患者[8-9]，但其神經保護機制尚不明確。

本實驗觀察高壓氧治療對脊髓損傷大鼠后肢運動功能恢復情況以及受損脊髓PERK蛋白表達的影響，探討高壓氧的神經保護機制，為高壓氧治療脊髓損傷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級成年雄性Sprague-Dawley大鼠36只，體質量200~250 g，購買于溫州醫科大學實驗動物中心，隨機分為正常組、假手術組、模型組和高壓氧組，每組9只。

本實驗已通過溫州醫科大學動物保護和使用委員會同意，符合實驗動物倫理學要求，實驗過程盡量降低動物的不適感，且使用最小數量的動物。動物均飼養于動物房清潔籠內，自由飲食、飲水，動物房室溫(22±2)℃，相對濕度50%~70%，動物房保持日夜12 h規律變化。

1.2 模型制作

5%水合氯醛6 ml/kg腹腔注射，術區常規碘伏消毒，定位于T10棘突，以此為中心，做一個約3 cm縱行切口，鈍性分離肌肉韌帶，暴露T9~T11棘突及椎板，用止血鉗小心咬除棘突及椎板，注意勿傷脊髓硬脊膜，充分暴露脊髓長度約1 cm。用紐約大學脊髓打擊器(New York University Impactor,NYU)[10]精確撞擊制作大鼠脊髓不完全損傷模型(T10打擊，2.5 cm×10 g)。以打擊后脊髓組織出現水腫，脊膜充血呈紫紅色，雙下肢回縮撲動，尾巴痙攣性擺動，弛緩性癱瘓即視為造模成功。縫合肌肉筋膜和皮膚，表面消毒，放回鼠籠飼養，術后早晚各一次協助脊髓損傷大鼠排尿、排便。

1.3 干預方法

正常組不做任何處理。假手術組僅暴露T9~T11節段脊髓，不打擊脊髓。模型組暴露T9~T11節段脊髓，打擊脊髓。高壓氧組暴露T9~T11節段脊髓，打擊脊髓，給予連續高壓氧治療7 d。

1.4 后肢運動功能情況

采用BBB(Basso,Beattie and Bresnahan)運動功能評分法[11]對實驗大鼠雙下肢功能恢復情況進行評分。分別于術前及造模后6 h、3 d、7 d，晚上19:00~20:00進行。將大鼠后肢功能分為22個等級，最小值0分，最大值21分。其中0~7分主要評判動物后肢各關節活動；8~13分主要評判下肢的步態及協調；14~21分主要評判運動中爪的精細動作。

1.5 高壓氧治療

高壓氧治療在大鼠急性脊髓損傷造模成功后6 h開始。將大鼠放置在紙箱內，放入單人高壓氧艙(DS400-Ⅳ型，濰坊華信氧業有限公司，中國山東)進行高壓氧治療。在純氧洗艙5 min后，采用純氧逐漸升壓至2個絕對大氣壓，穩壓吸純氧90~100 min，中間暫停15 min，最后經15~20 min逐漸減壓出艙。高壓氧治療時始終保持艙內氧濃度在95%以上。每次120 min，每天1次，連續治療7 d，治療后送回動物房內常規飼養。

1.6 標本取材

1.6.1 脊髓組織蛋白電泳標本制作

每組取實驗大鼠5只于術后7 d處死取材。5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，迅速打開胸腔，充分暴露心臟，灌注針經左心室插入主動脈，止血鉗將灌注管固定，剪開右心耳，200 ml生理鹽水由快到慢灌注至肝由紅色變為蒼白。在低溫下迅速切取損傷區脊髓約1.5 cm，置于液氮中，之后轉移至-80℃冰箱保存，用于Western blotting檢測。

1.6.2 HE染色標本制作

每組取實驗大鼠4只于術后7 d處死取材。5%水合氯醛6 ml/kg腹腔內注射麻醉大鼠，迅速打開胸腔，充分暴露心臟，灌注針經左心室插入主動脈，止血鉗將灌注針固定，剪開右心耳，生理鹽水行心臟灌注，灌注至肝肺變白，后改輸預冷4%多聚甲醛300~400 ml左右，灌注速度先快后慢，灌注過程中看到大鼠四肢和尾巴抽搐，待四肢脊柱變硬后即完成灌注，取出損傷節段脊髓1.5 cm，放于4℃的4%多聚甲醛中固定24 h，然后分別經15%、20%、30%蔗糖溶液梯度脫水沉底，找一個大小合適的模具，擠適量冰凍切片包埋劑(optimum cutting temperature,OCT)，然后放入脊髓組織，根據切的方向和部位調整好位置，OCT沒過脊髓組織，放進-80℃冰箱保存做冰凍切片。冰凍切片機上連續冠狀切片，片厚8μm，每隔4張取1張。

1.7 HE染色

室溫下風干切片，PBS浸泡10 min，蘇木素染色60 s，自來水沖洗30 s，自來水返藍5 min，伊紅染色1 min，自來水沖洗30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.8 Western blotting

取標本受損區脊髓1.5 cm置于勻漿管中，加入強裂解液RIPA、PMSF(100∶1)于勻漿器上搖勻震碎，4℃離心機12000 r/min，共15 min，提取上清進行蛋白檢測與定量。制膠(10%分離膠和5%濃縮膠)，100℃高溫使蛋白質變性后，進行SDS-PAGE電泳，電壓80 V，時間90 min。切膠濕轉至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜，PERK蛋白(分子量140 kD)轉膜120 min，內參 Tubulin(分子量 55 kD)轉膜60 min。轉膜結束后，將膜置于TBS液平衡5 min，5%脫脂奶粉封閉2 h。封閉結束后TBST洗膜5 min×3次，孵育兔源性PERK一抗(1∶1000，CELL SIGNALING公司)，兔源性Tubulin一抗(1∶1000)，4℃過夜。孵育一抗結束后TBST洗膜5 min×4次，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶5000，碧云天公司)室溫孵育1 h。TBST洗膜5 min×4次，ECL顯影。蛋白條帶用AlphaE-ascFC(FluorChem 8900)軟件分析，采用平均灰度值比值比較各組蛋白的表達差異。Tubulin作為內參，將指標灰度值與對應內參灰度值比值進行統計學分析。

1.9 統計學分析

用SPSS 19.0統計軟件分析所得數據，計量資料采用(xˉ±s)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用Student t檢驗統計顯著性，方差齊者予LSD檢驗，方差不齊者予Dunnett's T3檢驗。顯著性水平ɑ=0.05。

2 結果

2.1 BBB評分

術前四組BBB評分均為21分，穩定無變化。術后6 h，模型組和高壓氧組BBB評分為0分，造模成功。術后3 d和7 d，模型組BBB評分低于假手術組(P<0.05)。術后7 d，高壓氧組BBB評分高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時間段BBB評分

2.2 HE染色

正常組和假手術組均未見明顯結構異常。模型組損傷脊髓區域可見胞體腫脹，結構模糊，間隙增大，胞核固縮等病理結構。與模型組相比，高壓氧組組織水腫情況明顯減輕。見圖1。

圖1 各組損傷脊髓區HE染色(400×)

2.3 Western blotting

術后7 d，模型組PERK蛋白表達明顯高于假手術組(P<0.01)，高壓氧組PERK蛋白低于模型組相比(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 術后7 d各組脊髓PERK蛋白表達

圖2 術后7 d各組脊髓PERK蛋白條帶圖

3 討論

脊髓損傷是嚴重危害人類生存和生活質量的一類中樞性神經創傷。近年來，隨著交通運輸業和建筑業的快速發展，脊髓損傷的發病率逐年上升，尤其在中青年人群中高發，給患者、家庭、社會帶來嚴重的身心打擊和經濟負擔[12]。急性脊髓損傷由原發損傷和繼發損傷共同導致，繼發損傷通常是由級聯、進展性的局部組織破壞引起[13]。繼發損傷伴隨原發損傷而發生，可持續數周，主要表現為血管缺血、炎癥反應、神經興奮性毒性反應和自由基的釋放產生，最后導致神經細胞的死亡和組織破壞[14-15]。

高壓氧治療脊髓損傷是一種安全、有效的治療手段，高壓氧治療能有效促進脊髓功能恢復，縮短治療時間，降低致殘率，提高患者生活質量，具有明顯的社會效益。特別是在急性脊髓損傷早期接受高壓氧治療對功能恢復更有益處[9]。研究表明，高壓氧治療可在多方面阻止或逆轉頸髓損傷后的病理生理發展進程，如控制炎癥反應，增強神經修復和再生能力，促進血管再生，降低肌張力等，對脊髓損傷后脊髓功能恢復有促進作用[16-17]。

近年研究發現高壓氧治療脊髓損傷可能與抑制ERS介導的細胞凋亡有關。在脊髓損傷后，受損神經細胞存在著廣泛的ERS現象，ERS可能介導細胞死亡和修復過程[18-19]。當發生ERS時，機體會通過減少新生蛋白質的合成，增加伴侶分子的合成及錯誤折疊或未折疊蛋白質的降解來維持內質網的穩態平衡，即未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)[20]。當ERS持續存在時，UPR不能緩解內質網應激狀態，UPR中一些促凋亡信號通路被激活，分別為PERK信號通路、肌醇酶l(inositol requiring enzyme l,IREI)信號通路和活化轉錄因子6(the activating transcription factor 6,ATF6)信號通路，這3條信號通路均可激活細胞凋亡相關蛋白，從而誘導細胞凋亡，其中PERK信號通路是UPR中最先被激活，也是最主要的信號通路[21-22]。PERK信號通路可通過CHOP(C/EBP-homologous Protein)凋亡信號通路和胱天蛋白酶(caspase)介導的凋亡信號通路誘導細胞程序性死亡[23]。CHOP屬于C/EBP轉錄因子族的成員，CHOP是內質網應激發生凋亡的標志性基因，參與內質網應激調節的凋亡，并且CHOP基因表達缺陷的細胞顯著減少內質網應激誘導的細胞死亡[24]。PERK-eIF2α-ATF4-CHOP路徑是其產生的主要信號通路，PERK蛋白可通過磷酸化eIF2α抑制細胞中蛋白質的合成，同時PERK蛋白可介導的eIF2α磷酸化可選擇性介導轉錄活化因子4(ATF4)的mRNA表達水平升高，ATF4的翻譯水平顯著增加，通過上調CHOP基因的表達，最終通過激活caspase-3從而誘導細胞凋亡[25-26]。另外研究發現，PERK信號通路也可通過T細胞死亡相關基因51(T-cell death-associated gene 51,TDAG51)、核呼吸因子(nuclear respiratory factors,NRFs)和鈣離子等途徑直接或間接激活下游促細胞凋亡相關蛋白，從而引發細胞凋亡[23,27]。

有關研究發現，低氧環境可能誘導ERS的發生，與磷酸化PERK、CHOP蛋白的表達趨勢呈正相關，這說明低氧造成的組織損傷可能與ERS激活PERK通路，誘導CHOP蛋白高表達，從而介導細胞凋亡有相關性[22]。Liu等[19]研究脊髓損傷大鼠凋亡相關蛋白，發現與對照組相比，脊髓損傷大鼠的凋亡相關分子CHOP、caspase-3、caspase-12的mRNA和蛋白表達水平明顯增加。Wang等[28]研究發現，脊髓損傷大鼠高壓氧預處理后可促進抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達，降低凋亡相關分子caspase-3和caspase-9蛋白表達。

本研究采用2個絕對大氣壓高濃度純氧治療脊髓損傷大鼠，通過Western blotting觀察細胞凋亡上游重要的調控分子PERK蛋白。與模型組相比，高壓氧組脊髓損傷術后大鼠受損脊髓PERK蛋白表達明顯減少，說明高壓氧治療可抑制PERK蛋白表達，下調ERS誘導的細胞凋亡途徑，降低脊髓損傷誘導的細胞凋亡。HE染色觀察發現，與模型組相比，高壓氧組組織水腫情況明顯減輕。另外，高壓氧組7 d后的BBB運動評分高于模型組，說明高壓氧組脊髓損傷大鼠的運動功能水平明顯改善。因此，長期高壓氧治療可改善脊髓損傷大鼠受損的組織細胞，進而恢復其運動功能。

綜上所述，高壓氧治療可以改善脊髓損傷大鼠的運動功能水平，提示高壓氧治療可抑制PERK蛋白的表達，降低脊髓損傷誘導的細胞凋亡，從而起到一定的保護作用。