“三法三穴”推拿手法對坐骨神經損傷大鼠運動功能和脊髓NogoA及其受體表達的影響①

李易真，楊超，于天源，魯夢倩，苗潤培，呂桃桃

北京中醫藥大學，北京市100029

推拿能恢復周圍神經損傷后造成的感覺及運動功能失常，并能促進損傷后周圍神經修復和神經元存活[1-3]。周圍神經損傷后，損傷平面以上出現軸突和神經元胞體變性甚至死亡[4]。髓磷脂抑制信號通路在神經再生中起重要作用，NogoA是重要的髓鞘相關蛋白，其活性位點Nogo-66能與其受體NgR結合，抑制神經元再生[5]。本研究觀察坐骨神經損傷(sciatic nerve injury,SNI)大鼠脊髓內NogoA及受體NgR的表達，以及“三法三穴”推拿治療的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠64只，體質量(200±10)g，購自北京斯貝福實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0011。適應性飼養1周。

所有實驗程序均符合動物福利與倫理原則，并經北京中醫藥大學動物使用和管理委員會批準。

1.2 主要儀器與試劑

按摩推拿手法模擬儀：中國專利200710187403.1。Mini-P-2電泳槽、電泳儀：美國BIO-RAD公司。Fresco低溫冷凍離心機、MultiSkan3酶標儀：美國THERMO公司。水平脫色搖床：北京六一生物科技有限公司。電動組織勻漿器：美國FLUKA公司。

BCA蛋白定量試劑盒、2 mg/ml BSA標準品、10×TBST(pH=8.0)、彩虹245廣譜蛋白Marker(12條帶)：北京索萊寶科技有限公司。水合氯醛：滬試公司。兔源NgR抗體、兔源NogoA抗體：英國ABCAM公司。

1.3 方法

隨機數字表法將大鼠分為正常組、假手術組、模型組和推拿組各16只。

模型組和推拿組大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，俯臥位固定于消毒過的鼠板上，右側臀股交界處備皮、常規消毒，沿坐骨神經走行剪長約1 cm切口，鈍性逐層分離肌肉，暴露梨狀肌下緣及坐骨神經；彎鉤鑷確認坐骨神經后，用無齒10號持針器在距梨狀肌下緣5 mm處滿扣夾持坐骨神經5 s。逐層縫合，碘伏消毒。

假手術組同法顯露坐骨神經，但不做夾持。正常組不手術。

各組于造模術后7 d開始干預。推拿組束縛后，使用手法模擬儀依次刺激大鼠右側殷門、承山和陽陵泉[6]；模擬點法、撥法、揉法，力量4 N。每穴每法1 min，30次/min，共9 min。每天1次，治療7次休息1 d。

正常組、假手術組和模型組同法抓取，不作干預。

按摩推拿手法模擬儀主要由步進電機、圓盤、壓力傳感器和接觸點等組成，壓力傳感器和接觸點通過金屬條連接，使用導螺桿調節壓力。壓力大小顯示在屏幕上。接觸點是直徑10 mm的圓形光滑接觸面。

1.4 檢測方法

于術后7 d干預前及干預20 d時，每組取8只大鼠進行檢測。

1.4.1 斜板測試

斜板由兩塊矩形構成，表面鋪厚約6 mm的橡膠墊，斜面角度可測。在室溫、安靜狀態下，將大鼠頭向前，身體縱軸與斜板縱軸平行放置，逐漸抬高斜板，記錄大鼠能停留5 s而不跌落的最大角度。每只大鼠測量3次，取平均值。

1.4.2 Western blotting

大鼠斜板測試后，腹主動脈取血處死，迅速置于冰盤上，取L4-6節段脊髓，液氮冷凍，轉移至-80℃冰箱中保存備用。

每組選6個樣本組織，加入預冷RIPA裂解液3 ml充分研磨，12,000 r/min、4℃離心15 min，取上清液。BCA法測定蛋白濃度，取蛋白約10μg，加5倍SDS-PAGE上樣緩沖液。80 V電泳20 min，100 V電泳60 min。120 V轉膜120 min。加5%脫脂牛奶封閉60 min，1×TBST 10 min洗1次，共3次。將PVDF膜按蛋白分子量剪開，分別加入NogoA一抗(1∶1000)、NgR 一抗(1∶1000)和內參 β-actin 一抗(1∶3000)，搖床室溫孵育60 min，4℃過夜。1×TBST 10 min洗1次，共3次。加HRP-羊抗兔IgG二抗(1∶3000)，室溫搖床孵育60 min。1×TBST 10 min洗1次，共3次。ECL顯影，自然晾干后封存。應用Quantity One軟件計算目標條帶積分光密度(integrated optical density,IOD)。

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。所有數據均符合正態分布，以(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析，方差均齊，采用LSD t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 斜板測試

術后7 d，模型組與推拿組大鼠斜板測試評分低于正常組(P<0.05)和假手術組；干預20 d時，推拿組大鼠斜板測試評分低于正常組(P<0.05)，高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間點斜板測試結果(°)

2.2 Western blotting

術后7 d時，模型組和推拿組NogoA表達與正常組無顯著性差異(P>0.05)；干預20 d時，推拿組和模型組NogoA表達水平雖有升高趨勢，但仍無顯著性差異(P>0.05)，推拿組和模型組之間也無顯著性差異(P>0.05)。見圖1、表2。

術后7 d時，模型組和推拿組NgR表達較正常組升高(P<0.05)；干預20 d時，推拿組NgR表達較模型組降低(P<0.05)，與正常組無顯著性差異(P>0.05)。見圖2、表3。

圖1 各組NogoA蛋白表達(Western blotting)

表2 各組不同時間點NogoA蛋白表達(IOD)

圖2 各組NgRA蛋白表達(Western blotting)

表3 各組不同時間點NgR蛋白表達(IOD)

3 討論

本研究選取的穴位殷門、承山和陽陵泉，屬“穴位-神經-肌肉相關區域”。此三穴為足太陽膀胱經和足少陽膽經所過，符合針灸學循經取穴及局部取穴的原則。從解剖學角度分析，殷門位于坐骨神經干處，承山和陽陵泉分別位于坐骨神經分支脛神經和腓總神經上。三穴周圍為股二頭肌、腓腸肌、脛前肌，是能夠同時刺激穴位、神經和肌肉的最佳點。

周圍神經通過神經元將信息沿感覺和運動纖維傳遞，參與軀體與內臟運動、感覺和自主功能調節[7]。神經損傷后，損傷段的近、遠端將出現一系列病理、生理變化，神經元胞體、軸突、髓鞘、末梢感受器均會發生改變，從而發生感覺、運動功能障礙[8]。脊髓神經元支配周圍神經感覺和運動功能，當神經纖維受損后，支配該部分的脊髓神經元和軸突也會受損變性，影響神經功能。修復脊髓神經元和軸突，是恢復周圍神經功能的重要一環。

在中樞神經系統髓鞘中，有3種主要影響神經元軸突再生和修復的髓鞘相關抑制因子，分別是Nogo蛋白、髓鞘相關糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和少突膠質細胞髓鞘糖蛋白(oligoden-drocyte myelin glycoprotein,OMgp)[9-10]，這3種蛋白通過與其受體蛋白結合，形成信號通路，發揮抑制作用。

髓鞘相關抑制因子中以Nogo蛋白作用最為突出。NogoA的羧基端親水結構域Nogo-66是發揮抑制作用的主要部分。Fournier等[11]利用堿性磷酸酶融合技術發現與NogoA結合的受體結構NgR。NgR和Nogo-66有高度親和力，兩者結合形成信號通路，傳導抑制信號，作用于軸突細胞，誘導細胞生長錐坍塌，抑制軸突細胞的生長。抑制NgR1的表達可有效促進神經元軸突再生[12]。Liu等[13]發現，NgR不僅能與NogoA結合，還能與MAG和OMgp形成復合體，發揮同樣的軸突抑制作用。

NgR屬糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，具有多個富含亮氨酸的重復結構[14]。NgR需與神經營養因子p75(p75NTR)受體[15]和一種特異性定位于神經系統的蛋白質Lingo-1[16]特異性結合，共同介導軸突抑制作用。NogoA作用于神經元時，首先與該神經元胞膜蛋白中的NgR、p75NTR、Lingo-1結合，形成復合物，激活下游信號分子。

NgR是3種髓鞘抑制因子共同作用的靶點。使用NgR拮抗劑阻斷NogoA、MAG和OMgp與NgR的結合，是目前治療脊髓神經元損傷的常用途徑和研究熱點[17]。Gou等[18]發現，NgR1拮抗劑TAT-NEP1-40可對神經元提供保護作用，降低腦梗死容積，促進模型動物神經系統修復。Cao等[19]發現，NgR拮抗劑NEP1-40能促進側索損傷大鼠功能恢復和軸突再生。李鵬等[20]發現，新型NgR拮抗劑A3NEP1-40能促進周圍神經損傷處軸突的延伸，促進大鼠SNI后后肢運動功能恢復。

本研究顯示，推拿干預20 d后，能促進SNI大鼠患側肢體運動功能恢復。

本研究顯示，SNI大鼠L3-5脊髓內NogoA蛋白變化不明顯。閔友江等[21]對脊髓損傷大鼠NogoA蛋白不同時相的表達進行檢測，發現術后21 d時，NogoA含量達到峰值。周圍神經損傷后大鼠脊髓中NogoA的時相變化沒有檢索到相關文獻，需要進一步研究。推拿干預20 d后，大鼠NogoA蛋白有升高趨勢，與模型組相似，表明推拿對NogoA蛋白的抑制作用不明顯。李小琴等[22]發現，電針能抑制MAG蛋白表達，促進軸突再生，促進大鼠運動功能恢復。

本研究顯示，SNI大鼠L3-5脊髓內NgR蛋白表達增高，可能與軸突逆行性損傷導致抑制通路激活有關。SNI后，損傷平面以上的神經元軸突也出現損傷，引起髓磷脂抑制因子表達增高，NgR表達升高，發揮軸突抑制作用。推拿干預20 d后，NgR蛋白降低，可能是推拿發揮治療作用的機制之一。

前期研究顯示，推拿殷門、承山、陽陵泉可顯著改善大鼠感覺及運動功能，上調神經生長因子、神經絲蛋白等，保護神經纖維超微結構，促進神經功能恢復[23-25]。Pan等[26]研究顯示，推拿能調節損傷點遠端組織型纖溶酶原激活物與纖溶酶原激活物抑制劑的穩態，維持微環境修復能力，使其趨近于正常狀態，預防和解除膠原纖維形成結締組織瘢痕，為突觸重塑提供良好環境。推拿通過降低SNI大鼠脊髓中MAG和Rho相關激酶2的表達，抑制微管與神經絲解聚，維護神經元細胞骨架結構的穩定[27]。

NogoA通過與NgR結合發揮軸突抑制作用。推拿可降低脊髓中NgR蛋白表達，促進軸突再生，起到類似NgR拮抗劑的作用。其機理可能包括抑制Ca2+內流、穩定神經遞質濃度、上調神經營養因子分泌等多種途徑，有待進一步研究。

綜上所述，推拿手法可通過降低SNI后NgR蛋白在相應節段脊髓內的表達，阻斷軸突抑制通路的激活，保護神經元，進而促進軸突再生，最終改善SNI大鼠運動功能。