醇醚硫酸鹽AES降解菌的篩選鑒定及生物降解特性研究

曾典　唐啟玲　龐志宇　杜全能　蘭時樂

摘要? ? 為了獲得陰離子表面活性劑醇醚硫酸鹽（AES）降解菌并應用于AES的降解，從湖南麗臣實業股份有限公司污水處理池污泥中分離篩選到1株能以AES為唯一碳源生長且能高效降解AES的細菌，命名為Z-8。通過形態學觀察、生理生化試驗和16S rDNA序列分析及系統發育樹的構建對菌株進行鑒定，探討了AES初始濃度、溫度、初始pH值和發酵時間對AES降解率的影響。結果表明，菌株Z-8被鑒定為Pseudomonas knackmussii Z-8，對AES的耐受力可達1 400 mg/L。適宜的降解條件為AES初始濃度400 mg/L、培養溫度32 ℃、初始pH值9.0和發酵時間9～12 h，在此條件下，AES降解率達99.59%。試驗結果顯示了克氏假單胞菌Z-8在處理含AES廢水中具有良好的應用前景。

關鍵詞? ? 醇醚硫酸鹽（AES）;菌株鑒定;生物降解;16S rDNA序列分析

中圖分類號? ? X172? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2019）24-0138-04? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract? ? In order to obtain anionic surfactant alcohol ether sulfate（AES）degrading bacteria and apply to AES degradation.A strain named Z-8 was isolated from sludge of sewage treatment pond of Hunan Lichen Industrial Co.，Ltd.，which could grow with AES as the sole carbon source and degrade AES efficiently. The strain Z-8 was identified by morphological observation，physiological and biochemical tests，16S rDNA sequence analysis and phylogenetic tree construction. The effects of AES initial concentration，cultural temperature，initial pH value and fermentation time on AES degradation rate were discussed. The results showed that strain Z-8 was identified as Pseudomonas knackmussii Z-8，and its resistance to AES was up to 1 400 mg/L.The optimum degradation conditions were AES initial concentration 400 mg/L，incubation temperature 32 ℃，initial pH value 9.0 and fermentation time 9-12 h. Under these conditions，the degradation rate of AES reached 99.59%. The experimental results showed that Pseudomonas knackmussii Z-8 had a good application prospect in the treatment of wastewater containing AES.

Key words? ? alcohol ether sulfate（AES）;strain identification;biodegradation;16S rDNA sequence analysis

脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉（AES）是一種性能優良的陰離子型表面活性劑，因其具有優良的去污能力、乳化發泡性能、抗硬水性能以及生物降解性[1]而被廣泛用于香波、浴液、餐具洗滌劑、復合皂等洗滌化妝用品中，其用量僅次于直鏈烷基苯磺酸鹽（LAS）。盡管AES濃度低時危害并不明顯，但濃度過高，會使皮膚干燥并破壞保護皮膚表面的自然油脂、蛋白質，以及通過皮膚被身體吸收進入肝臟，還可能造成男性精子成活率下降，提高女性患子宮癌和乳腺癌的機率[2]。AES進入土壤和水體后，能在水體中產生大量的持久性泡沫[3]，阻斷水體與空氣的交換，減少水體中的溶解氧，影響水體中魚類和水生無脊椎動物的生長，同時有研究表明長期接觸和使用AES可降低小鼠血清中超氧化物歧化酶的含量，使得小鼠體內抗氧化能力的降低，從而影響其正常生理功能[4]。

目前已經報道污水中陰離子表面活性劑降解方法主要有振蕩培養法、活性污泥模擬法、開放（密閉）法等[5]。對于從自然界分離純化微生物并應用于非離子表面活性劑的降解主要集中于十二烷基苯磺酸鈉（LAS）的降解研究。國內研究工作者分離出了能有效降解LAS的芽孢桿菌（Bacillus sp.）[6]、黃單胞菌（Xanthomonas sp.）[7]、可動苯基桿菌（Phenylobacter-ium mobile）[8]等，但對陰離子表面活性劑中的AES生物降解方面的研究較少，僅有董慶斌等[9]用活性污泥對AES進行了生物降解性的研究，而從自然界分離微生物并對微生物進行鑒定和研究AES微生物降解特性的研究，國內外未見文獻報道。

目前，國內外對AES的研究主要側重于其生產工藝[10]、貯存條件[10-13]、應用性能[3，14-15]，但未發現研究AES的微生物降解菌種的篩選、生物降解工藝和生物降解特性。筆者從湖南麗臣實業股份有限公司污水處理池污泥中分離到1株能高效降解脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉（AES）的細菌菌株Z-8，初步研究了AES濃度、發酵溫度、培養基初始pH值和發酵時間等對AES降解的影響，以期為菌株Z-8對AES污染進行生物修復和拓寬其應用范圍提供參考。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

1.1.1? ? 菌株分離樣品。取自湖南麗臣實業股份有限公司污水處理池中的污泥，置于無菌廣口玻璃瓶中，立即帶回實驗室進行AES降解菌的富集和分離。

1.1.2? ? 培養基。①富集培養基：AES 0.4 g，NH4Cl 3 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.25 g，K2HPO4 1 g，FeSO4 0.001 g，H2O 1 000 mL，pH值7.2～7.4。②篩選培養基：培養基成分與富集培養基相同，另加2%的瓊脂。③斜面培養基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20.0 g，H2O 1 000 mL，pH值7.0～7.2。④液體種子培養基：培養基成分與斜面培養基成分相同，但不加瓊脂粉。⑤發酵培養基：AES 0.04%，NH4Cl 0.3%，MgSO4·7H2O 0.02%，KCl 0.02%，K2HPO4 0.1%，pH值7.0。

以上培養基均在121 ℃條件下滅菌25 min。

1.1.3? ? 主要儀器與藥品。主要儀器設備：電子天平（TMP-510，湘儀天平儀器設備有限公司）;分析天平（AL204，梅特勒—托利多儀器有限公司）;恒溫培養箱（MJ-160C，上海博訊實業有限公司醫療設備廠）;高溫高壓滅菌鍋（SS-325，TOMY.KOGYO.CO.，LTD）;單人單面超凈工作臺（SW-CJ-1B（U），蘇州設備凈化有限公司）;DNA電泳槽（DYCP-31DN，北京六一儀器廠）;穩壓電泳儀（DYY-5，北京六一儀器廠）;凝膠成像儀（FR980，上海復日科技儀器有限公司）;PCR儀（2720 thermal cycler，Applied Biosystems）;冷凍高速離心機（HC-2518R，BBI）。

主要藥品：AES（70%，山東優索化工科技有限公司）;NH4Cl、KCl、FeSO4、MgSO4·7H2O、K2HPO4（AR，國藥集團化學試劑有限公司）;瓊脂（BP，合肥博美生物科技有限責任公司）;牛肉膏、蛋白胨（BP，上海盛思生化科技有限公司）。

1.2? ? 試驗方法

1.2.1? ? 培養。斜面培養：將保存于4 ℃冰箱中的菌種接種于斜面培養基表面，37 ℃恒溫培養24～36 h，備用。液體種子培養：將活化后的斜面菌種接種于液體培養基中，37 ℃，170 r/min條件下恒溫培養24 h。發酵培養：按2%（V/V）的接種量將培養好的液體種子接種于裝有發酵培養基100 mL/300 mL三角瓶中，37 ℃，170 r/min條件下恒溫培養48 h，測定培養液中AES含量，并計算AES降解率。3次重復。

1.2.2? ? 菌種的篩選與鑒定。

（1）菌種初篩與復篩。稱取5.00 g污泥樣品接入100 mL富集培養基中，于37 ℃、170 r/min恒溫振蕩培養箱中富集培養3 d后，按照10倍稀釋法[16]將富集液進行稀釋，取最后3個不同稀釋度的稀釋液0.1 mL涂布于篩選培養基平板上，涂布均勻，于37 ℃細菌培養箱培養至長出單菌落。挑取單菌落于選擇培養基平板表面劃線純化，直至顯微鏡鏡檢時菌體形態一致為止，保存并編號。將保存于斜面的菌株分別接入液體種子培養基中，37 ℃，170 r/min條件下振蕩培養24 h后，按2%（V/V）的接種量接入含400 mg/L AES的發酵培養基中，同樣條件下恒溫振蕩培養48 h，分別測定培養液中AES的含量，并計算AES的降解率。

（2）形態學及生理生化特征。將分離得到的AES降解菌涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養基表面，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察菌落形狀、大小、顏色、表面特征及革蘭氏染色。菌株的生理生化試驗參照文獻[17]中方法進行。

（3）16S rDNA基因序列及系統發育分析。用牛肉膏蛋白胨液體培養基培養菌株Z-8 24 h后，采用上海生工生物工程Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒進行DNA提取。以提取的基因組DNA為模板，擴增16S rDNA基因片段。正向引物序列：27F：5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物序列：1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增反應體系為25 μL，包括Template（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1 μL、Taq酶0.2 μL、正向引物（10 μmol/L）0.5 μL、反向引物（10 μmol/L）0.5 μL，加雙蒸水定容至25 μL。PCR 反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s;55 ℃退火45 s;72 ℃延伸1 min;30個循環;72 ℃修復延伸10 min;4 ℃保存。測序由上海生工生物工程有限公司完成。通過BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）將16S rDNA序列與GenBank數據庫中的序列進行比對，并提交給GenBank。采用NJ法，用MEGA7.0.26構建系統發育樹。

1.2.3? ? 菌株Z-8降解AES特性研究。

（1）AES濃度對菌株Z-8降解AES的影響。在培養基中分別添加400、600、800、1 000、1 200、1 400 mg/L的AES，于37 ℃、170 r/min條件下培養48 h，其他條件不變，測定培養液中AES含量，并計算AES的降解率。

（2）培養溫度對菌株Z-8降解AES的影響。在上述試驗結果的基礎上，將三角瓶分別置于28、30、32、35、37 ℃條件下，170 r/min恒溫振蕩培養培養48 h，其他條件不變，測定培養液中AES含量，并計算AES的降解率。

（3）培養基初始pH值對菌株Z-8降解AES的影響。在上述試驗結果的基礎上，用稀酸或稀堿調節培養基初始pH值分別為3、5、7、9和11，其他條件不變，測定培養液中AES含量，并計算AES的降解率。

（4）培養時間對菌株Z-8降解AES的影響。在上述試驗結果的基礎上，將三角瓶在適宜的條件下培養，每隔3 h取樣測定發酵液中AES含量，并計算AES的降解率，直至培養48 h為止。

1.2.4? ? AES含量測定。

（1）發酵液預處理。將培養好的發酵液于4 ℃，10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，測定AES的含量。以不接種為對照。

（2）AES含量測定。參照文獻[18]提供的亞甲藍比色法（美藍法）進行測定。AES降解率計算公式如下：

D（%）=（m0-mn）/m0×100

式中：D為第n小時后AES的降解率（%）;m0為初始表面活性劑質量（mg）;mn為第n小時后表面活性劑質量（mg）。

2? ? 結果與分析

2.1? ? AES降解菌的篩選與鑒定

2.1.1? ? AES降解菌的初篩與復篩。通過富集、篩選培養后，共得到8株能以AES為唯一碳源生長的細菌菌株，分別命名為Z-1、Z-2、Z-3、Z-4、Z-5、Z-6、Z-7、Z-8。將8株菌株分別接入含400 mg/L AES的發酵培養基中，37 ℃、170 r/min條件下恒溫振蕩培養48 h后，分別測定培養液中AES的含量，并計算AES的降解率。結果見圖1。可以看出，不同菌株在上述條件下對AES的降解率不同。所分離的菌株中，菌株Z-8對AES的降解率最強，達到99.67%。其他7個菌株對AES的降解率均<60%。因而選擇菌株Z-8為試驗菌株進行后續試驗。

2.1.2? ? 菌株Z-8形態學觀察。菌株Z-8在以AES為唯一碳源的篩選培養基上菌落灰白色、圓形、表面潮濕、邊緣整齊、不透明。在光學顯微鏡下菌體為短桿狀、無芽孢、革蘭氏染色為陰性。

2.1.3? ? 生理生化試驗結果。菌株Z-8生理生化指標見表1。

2.1.4? ? 系統發育樹構建。菌株Z-8的16S rDNA測序結果在GenBank中進行Blast比對分析，其序列全長為1 404 bp，與假單胞菌屬的16S rDNA基因序列相似度最高。選擇Pseud-omonas aeruginosa（GQ926936.1）作為外類群，采用NJ法，用MEGA7.0.26構建與假單胞菌屬部分模式種16S rDNA基因系統發育樹。結果見圖2。

由圖2可知，菌株Z-8與Pseudomonas knackmussii（HG322950.1）的親緣關系最近，同處一個進化分支。綜合菌落形態特征、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析以及系統發育樹構建結果，將菌株Z-8初步鑒定為Pseudomonas knackmussii Z-8。

2.2? ? 菌株Z-8降解AES特性研究

2.2.1? ? 初始濃度對菌株Z-8降解AES能力的影響。從圖3可以看出，菌株Z-8在AES初始濃度400～1 400 mg/L均具有降解AES的能力。當AES濃度在400～800 mg/L范圍內，其降解率均>90%，而在培養基中AES初始濃度為400 mg/L時，AES降解率最大，達到了99.38%。但隨著培養基中AES濃度的增加，AES降解率下降。當培養基中AES初始濃度達到1 400 mg/L時，AES的降解率僅為2.87%，表明高濃度的AES對菌株Z-8具有顯著的生長抑制作用，從而影響其降解效率。因此，選擇培養基中AES初始濃度為400 mg/L進行后續研究。

2.2.2? ? 培養溫度對AES降解率的影響。培養溫度主要影響細胞內代謝酶的活性、細胞膜的流動性和通透性以及影響物質的溶解度，從而影響微生物的生長和代謝。培養溫度低，代謝酶活性低;培養溫度高，代謝酶容易變性失活，均會造成細胞內酶促反應的下降，影響細胞內生物物質的合成。溫度對AES降解率的影響結果見圖4?？梢钥闯觯斉囵B溫度為32 ℃時，AES的降解率最高，達99.54%;隨著培養溫度的升高，AES的降解率緩慢下降。在30～37 ℃培養溫度范圍內，AES降解率均>99%，但彼此之間差異不顯著。因此，選擇培養溫度為32 ℃進行后續試驗。

2.2.3? ? pH值對AES降解率的影響。由圖5可知，培養基pH值對菌株Z-8降解AES的影響較大，在一定的pH值范圍內，隨著培養基pH值的升高，AES的降解率也隨之提高。當培養基初始pH值為9.0時，AES降解率達到99.47%，但當培養基初始pH值>9.0，AES降解率顯著下降。主要原因為環境的酸堿度能引起細胞膜電荷的變化和細胞內電解質的平衡以及細胞結構的改變，影響細胞對營養物質的吸收和代謝酶系的活性，從而降低細胞對AES的利用率。

2.2.4? ? 培養時間對AES降解率的影響。由圖6可知，AES降解率隨著培養時間的延長而提高。當培養時間為9 h時，AES降解率達到98.78%，繼續延長培養時間，雖然在12～48 h內，AES降解率均>99%，但各處理之間差異并不顯著。因此，選擇培養時間為9～12 h。

3? ? 結論

從湖南麗臣實業股份有限公司污水處理池污泥中篩選到1株能以AES為唯一碳源的AES高效降解菌株Z-8，根據16S rDNA基因序列分析比對及形態學觀察和生理生化特征，將其鑒定為Pseudomonas knackmussii Z-8。AES生物降解特性試驗表明，菌株Z-8能適應高濃度醇醚硫酸鹽，其濃度可達1 400 mg/L。AES濃度、培養溫度、培養基初始pH值和培養時間對AES降解率影響結果表明，在AES初始濃度為400 mg/L，培養溫度32 ℃，培養基初始pH值9.0和培養時間9～12 h條件下，AES降解率可達99.59%，表明該菌在處理含較高濃度AES廢水中具有極好的應用前景。

4? ? 參考文獻

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