特異性蛋白轉錄因子1在乳腺癌中的研究進展

胡 楊綜 述，吳雄志審 校

（天津醫科大學腫瘤醫院中醫科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津300060）

乳腺癌已成為危害人類健康的主要疾病之一，在女性惡性腫瘤發病率中居首位。據預測，到2020年，全球將有超過197萬名女性患上乳腺癌，其中622 000萬人將死于這種疾病[1]。由于乳腺癌的高發病率和死亡率，尋找有效靶點和新的治療策略至關重要。腫瘤的發生涉及到多種基因表達活性的改變，轉錄因子作為基因表達的終端調節因子，有望成為治療乳腺癌并改善其耐藥性的有效靶點[2]。特異性蛋白（specificity protein，Sp）轉錄因子屬于Sp/Kruppel樣鋅指轉錄因子家族，在胚胎期和出生后早期發育過程中起重要作用[3]。Sp1是該家族中研究最為廣泛的成員，在人類癌癥發展過程中起著關鍵的作用。目前已有許多研究表明，Sp1在肺癌、胰腺癌和乳腺癌等腫瘤中過表達，并與腫瘤的高度侵襲性以及不良預后有關[4]。在乳腺癌中，Sp1能夠調節與癌細胞增殖、分化和轉移有關的許多基因的表達，與乳腺癌的發生發展以及治療和預后均密切相關[5]。因此，Sp1是治療乳腺癌的重要靶點之一。本文回顧了Sp1在乳腺癌細胞凋亡和增殖、遷移和侵襲中的作用，總結了近年來針對Sp1為靶點的治療藥物。以期為以后尋找新的乳腺癌治療策略提供參考。

1 Sp1的結構和功能

1.1 Sp1的基本結構 Sp1是Sp/Kruppel樣鋅指轉錄因子家族的一員，由位于人類基因組中12q13.1基因座的Sp1基因編碼[2]。如圖1所示，Sp1分為4個不同的結構域（A，B，C和 D），共由 785個氨基酸組成。結構域A和B富含谷氨酰胺氨基酸并且作為反式激活結構域（transactivation domain,TAD）起作用，能夠與轉錄因子IID的組分即TATA結合蛋白（TATA binding protein，TBP）和TATA結合蛋白相關因子4（TATA box binding protein associated factor 4，TAF4）直接相互作用。結構域C是包含12個陰性和6個陽性電荷的高度電荷區域，具有協同Sp1的DNA結合以及轉錄激活作用。結構域D為Sp1特有的多聚化結構域，可通過兩個或多個Sp1分子之間的相互作用而調節Sp1的轉錄激活。在Sp1的C末端，結構域C和D之間具有3個Cys2-His2型鋅指模序，為Sp1的DNA結合結構域。除以上結構外，Sp1的N末端具有一個小的抑制結構域（inhibitory domain，ID），能夠通過與輔抑制因子相互作用來調節結構域A和B的功能[3]。

ID區域為抑制結構域；區域A和區域B為轉錄激活區域；區域C為高度帶電荷區域；區域D為Sp1特有的多聚化結構域；區域C和區域D之間為Sp1的3個Cys2-His2樣鋅指結構

1.2 Sp1的主要功能 Sp1的蛋白結合位點被稱為Sp1位點，人類基因組中至少有12 000個Sp1結合位點，Sp1借助于其鋅指結構與其靶基因的GC框結合，進而對靶基因進行調節[6]。Sp1作為一種重要的轉錄因子，調控多種細胞不同的生物學效應，包括胚胎早期發育，細胞的生長、增殖、分化、凋亡、遷移以及EMT（上皮間質轉化）等[7]。此外，Sp1在腫瘤的發生發展過程中也具有重要作用，其在包括乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、腦癌（膠質瘤）和甲狀腺癌等腫瘤中過表達，并且Sp1的水平常與腫瘤的分期、侵襲潛能以及轉移相關，高水平的Sp1往往預示不良預后[4]。

2 Sp1與乳腺癌

2.1 Sp1在乳能癌增殖和凋亡中的作用

2.1.1 參與腫瘤細胞周期的調控 腫瘤的發生主要表現為細胞周期失控，不受正常生長調控系統的控制，能持續的分裂與增殖。在細胞生長的過程中，細胞周期主要分為4個連續的階段：G1（DNA合成前期），S（DNA 復制或合成期），G2（DNA合成后期）和M（有絲分裂期）。真核細胞的細胞周期進程由3個關鍵組分調控：細胞周期蛋白，細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases,CDK），細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cell cycle dependent kinase inhibitors,CDKI）。當Sp1的作用在乳腺癌細胞系中被阻斷時，細胞周期蛋白D1（cell cycle protein D1,CD1）的表達明顯下降，細胞增殖能力減弱并逐漸發生凋亡[8]。作為細胞周期依賴性激酶抑制劑（CDK interacting protein/kinase inhibition protein，CIP/KIP）家族中的一員，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21 cip1（CDK-interacting protein 1，p21 Cip1）可在細胞周期的所有階段抑制CDK的活性,其啟動子區域含有Sp1結合位點，當使用siRNA將Sp1水平降低時,p21Cip1 mRNA水平也顯著降低[9]。此外，Wei等[10-11]通過研究發現：信號轉導和轉錄激活因子6（signal transducer and activator of transcription6，Stat6）能夠作為Sp1的輔因子與p21 Cip1基因啟動子區域的Sp1結合位點結合，促進p21 Cip1基因的表達，進一步抑制乳腺癌細胞增殖；孕激素受體（progesterone receptor，PR）與孕酮結合后也能通過與Sp1的相互作用來激活p21 Cip1基因的表達；Stat6還能與PR協同作用于p21 Cip1基因啟動子的Sp1結合區域，共同激活p21Cip1的轉錄。鋅指和BTB結構域蛋白8A（zinc finger and BTB domain-containing protein 8A，ZBTB8A）作為鋅指和BTB結構域蛋白（zinc finger and BTB domaincontaining protein，ZBTB）家族中的一員，在調控腫瘤的發生發展以及細胞的增殖和凋亡中具有重要作用。Min-Kyeong Kim等[12]發現，ZBTB8A能夠與Sp1競爭結合p21 cip1近端啟動子的GC盒，進而抑制p21 cip1的轉錄，促進細胞的增殖。由此可見，Sp1在多種細胞因子調節p21 cip1的通路中起到樞紐作用，但腫瘤細胞中調節p21 cip1表達的因子遠不止上述所提及的，今后在對其他細胞因子調節p21 cip1的研究過程中，我們應把Sp1對p21 cip1的影響也考慮在內。與此同時，Sp1在不同的分子之間的相互作用過程中也具有一定的橋梁作用，hang等[13]通過研究發現，癌蛋白乙型肝炎病毒X相互作用蛋白（hepatitis B X-interacting protein,HBXIP）能夠通過激活Sp1來上調血小板衍生生長因子β多肽（platelet-derived growth factor beta polypepti；de,PDGFB）的表達進而促進乳腺癌細胞的增殖。此外，HBXIP還能夠通過Sp1激活LIM結構域蛋白4（LIM domain protein 4，LMO4）啟動子，間接增強細胞周期蛋白（如細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白E）的表達，進一步促進乳腺癌細胞的增殖[14]。由于Sp1對于細胞周期相關蛋白影響的范圍很廣，現有的研究仍是冰山一角，以Sp1為靶點的藥物研究也只是處于基礎研究階段，今后需要更多的研究去建立以Sp1為中心的細胞因子調控網絡，為臨床治療乳腺癌提供更全面的理論支撐。

2.1.2 對腫瘤細胞凋亡的影響 細胞凋亡是由基因控制的細胞自主性的程序性死亡，在維持內環境穩定中具有重要作用。逃避凋亡是癌細胞的一個標志，是導致癌癥患者化療后發生抵抗的主要原因。胰島素樣生長因子受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF1R）具有很強的抗凋亡和抗有絲分裂活性，在包括乳腺癌的許多腫瘤中過表達，Sp1是一種有效的IGF1R基因轉錄激活因子，在乳腺癌中，雌激素能夠通過激活轉錄因子Sp1而進一步激活IGF1R啟動子，最終抑制癌細胞凋亡[15]。髓細胞白血病基因-1（myeloid cell leukemia-1,Mcl-1）是抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族的成員之一，其參與線粒體介導的細胞凋亡的內在途徑。雌激素受體α（estrogen receptor α,ERα）是維持Mcl-1表達的重要調節因子，通過作用于Mcl-1啟動子內與Sp1位點復合的特定半ERE位點，促進Mcl-1的表達，允許ERα陽性的乳腺癌細胞逃避凋亡，并且可以抵消翻譯后的Mcl-1降解[16]。含I型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 motifs,17,Adamts17）是分泌型金屬蛋白酶家族的成員之一，能夠通過調節乳腺癌細胞系中的抗凋亡程序來調控細胞的存活，抑制Adamts17的表達能夠抑制細胞生長并導致細胞凋亡。Jia等[17]研究發現Sp1與Adamts17近端啟動子區域的結合對Adamts17基礎水平的表達具有重要作用。此外，Sp1在雌激素誘導的Adamts17表達中具有重要作用，將Sp1 siRNA轉染到MCF-7細胞中能夠顯著降低內源性雌激素誘導的Adamts17表達。通過上述總結我們可以看出，Sp1對于乳腺癌細胞凋亡的調控作用并不是獨立的存在，雌激素在其調控過程中起關鍵作用，在以Sp1為靶點采取治療措施的同時，協同抑制雌激素是否能達到更好的效果目前尚未見報道，但這種協同抑制作用值得我們進一步研究。除與雌激素的相互作用外，Sp1還能與其他一些轉錄因子相互作用而影響凋亡相關基因的表達。核激素受體轉錄共激活因子3（amplified in breast cancer 1，AIB1）是一種致癌基因，Sp1相關的轉錄復合物能夠顯著增加AIB1基因的共激活。Li等[17]發現，DNA結合轉錄共抑制因子叉頭框G1（forkhead box G1，FOXG1）能夠破壞Sp1相關轉錄復合物，導致轉錄因子E2F1（E2F transcription factor 1,E2F1），AIB1和p300從Sp1分離，從而減少AIB1基因轉錄進而導致乳腺癌細胞的凋亡。組蛋白甲基化轉移酶（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）在多種類型的癌癥中過表達，其異常升高常與乳腺癌的侵襲和增殖能力增強相關，Sp1能夠與EZH2啟動子富含GC的區域結合，調節其轉錄。鋅指和BTB結構域蛋白4（zinc finger and BTB domain-containing protein 4，ZBTB4）作為一種轉錄抑制因子，能夠通過抑制Sp1與EZH2啟動子結合而抑制其轉錄進而促進癌細胞凋亡[18]。Sp1除了對凋亡相關蛋白有調節作用外，其與微小核糖核酸（microRNA，miRNA）的相互作用也能對細胞的凋亡產生一定的影響。miRNA是一種小的內源性非編碼RNA分子，大約由21-25個核苷酸組成，這些小的miRNA能夠通過翻譯水平的抑制或斷裂靶標mRNAs而調節基因的表達。Yao等[19]發現，miR-200b能夠通過直接作用于Sp1的3’UTR（3’非翻譯區）而下調 Sp1的表達，進而抑制乳腺癌細胞的增殖，促進其凋亡。因此，Sp1在乳腺癌細胞凋亡過程中的作用不只是單純的與相應基因中的Sp1結合位點的結合，許多與乳腺癌發生發展相關的蛋白質或者小分子物質均可通過與Sp1的相互作用而增強其自身的致癌作用，因此，在以后研究靶向作用于Sp1的藥物過程中，尋找多靶點的治療藥物至關重要。

2.2 Sp1在乳腺癌遷移和侵襲中的作用 癌癥細胞的遷移和侵襲是腫瘤轉移的前提。血管生成在各種癌癥（包括乳腺癌）轉移中起重要作用。在形成新血管所需的各種因素中，VEGF、EGF、TGFβ已被確定為乳腺癌血管生成的關鍵因素[20-21]。研究發現，VEGF-C在乳腺癌中過表達與較高的Sp1表達水平相關，抑制Sp1能夠進一步抑制Sp1介導的VEGF-C的表達[20]。除了調節VEGF-C基因的表達，Sp1還能與EGFR啟動子區域結合并調節其轉錄活性，為EGFR基礎轉錄所必須并在TGF-β誘導的EGFR上調過程中起主要作用[21]。基于以上的機制研究，我們可以提出抑制轉錄因子Sp1將導致VEGF-C、EGF、TGFβ表達下調進而導致血管生成減少和抑制腫瘤轉移的假設。在血管生成過程中，血管基底膜的降解以及細胞外基質的重塑能進一步促進細胞的遷移，細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子（cluster of differentiation 147，CD147）是一種屬于免疫球蛋白超家族的58-kDa跨膜糖蛋白，能夠降解細胞外基質并促進乳腺癌細胞轉移，Sp1能夠通過與CD147啟動子結合來增強其表達[22]。在結腸癌中，去甲斑蝥素作為一種轉移抑制劑能夠通過降低Sp1與基質金屬蛋白酶啟動子的結合而下調其表達[23]，提示今后可以Sp1為靶點發現類似的轉移抑制劑來治療乳腺癌的轉移。此外，原癌基因c-Src在調控細胞的分化和遷移中也具有重要作用，跨膜糖蛋白CD44能夠通過調節Sp1的表達而影響c-Src的轉錄，在人乳腺癌細胞中，CD44的沉默能夠降低Sp1 mRNA和蛋白的表達，抑制其與c-Src啟動子結合，進一步引起c-Src mRNA水平的下調，抑制乳腺癌細胞的遷移[24]。

2.3 Sp1與EMT 上皮-間質轉化（EMT）是涉及腫瘤侵襲、轉移、胚胎發育和傷口愈合的重要過程。在正常組織中，細胞利用細胞膜糖蛋白如E-鈣粘蛋白建立緊密連接，相鄰的上皮樣細胞通過細胞表面E-鈣粘蛋白相互結合。在EMT過程中，E-鈣黏蛋白抑制因子SNAIL蛋白、鋅指E盒結合蛋白1/2（Zinc finger E-box-binding homeobox 1/2，ZEB1/2）和 Twist相關蛋白 1（Twist-related protein 1，TWIST1）表達上調，上皮細胞逐漸失去其上皮分子特征，同時獲得間充質標志物如N-鈣黏蛋白、整合素α5、波形蛋白等。Sp1是調控EMT過程的關鍵轉錄因子之一，能夠通過抑制E-cadherin的表達進而促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[25]。Kwon等[26]研究發現，Sp1不僅能夠直接調節β-連環蛋白、ZEB1和TWIST1的轉錄活性并啟動EMT，而且還在細胞色素P450 1B1（cytochrome p450 1B1,CYP1B1）誘導EMT的過程中發揮重要作用，在Sp1敲除的細胞中，CYP1B1誘導的ZEB2、SNAIL蛋白和波形蛋白的表達水平顯著降低。此外，轉錄因子ZEB2以及C反應蛋白（C-reaction protein，CRP）能夠通過激活Sp1進一步激活整合素α5和整合素α2的表達，以非E-cadherin依賴的方式誘導EMT[27]。由此可以看出，Sp1在乳腺癌的EMT的過程中具有承上啟下的關鍵作用，若以Sp1為靶點抑制其表達，上皮細胞中E-鈣粘蛋白抑制因子的表達也會隨之受到抑制，EMT過程就會得到一定的緩解，有望為其他治療贏得一定的窗口時間。除了通過抑制E-cadherin的表達來促進EMT外，Sp1在TGFβ促進EMT的發展過程中也具有重要作用：ZU等[28]研究表明TGF-β1能夠通過增加原癌基因高遷移率蛋白家族A1（high mobility group A1,HMGA1）的表達來促進EMT。HMGA1啟動子序列中含有Sp1結合位點，TGF-β1通過激活Sp1磷酸化增強了其與HMGA1啟動子的結合，進一步誘導HMGA1的表達。β-半乳糖苷α2、6-唾液酸轉移酶1（ST6GAL1）的過表達能夠促進TGF-β誘導的EMT，其啟動子序列中的Sp1結合位點是為TGF-β誘導的EMT過程中ST6GAL轉錄活化所必需[29]。然而，Tsang-Chih Kuo 等[30]發現，ANGPTL1 血管生成素樣蛋白 1（angiopoietin-like protein 1，ANGPTL1）能以Sp1依賴性方式來誘導miR-630的表達，進一步抑制鋅指蛋白SLUG的表達及上皮間質轉化，在體外能夠抑制肺癌和乳腺癌細胞的遷移和侵襲。由此可見，Sp1在調節乳腺癌EMT的過程中具有兩面性，通過調節不同的基因能對EMT產生不同的影響，如何通過調節Sp1來抑制腫瘤發生過程中的上皮間質轉化仍需進一步研究。

2.4 Sp1與其靶向治療 Sp1靶向調控乳腺癌各種過程中（如增殖、遷移/侵襲、血管生成和細胞凋亡）的基因表達,在乳腺癌中具有重要作用。因此，使用小分子來抑制Sp1將是理想的基于機制的抗癌療法。在這方面，幾種小分子物質如光神霉素、托芬那酸和樺木酸已成功用于靶向Sp1，抑制乳腺癌細胞的生長。

2.4.1 光神霉素 光神霉素是由鏈霉菌屬中的各種土壤細菌產生的聚酮化合物。它是一種具有強效抗癌活性的DNA結合劑，能與富含GC的序列結合導致Sp1從其位點的置換或抑制Sp1與其位點結合。據報道，光神霉素在多種癌癥中具有抗腫瘤活性，Liu等[31]發現，光神霉素能夠通過下調Sp1來抑制三陰性乳腺癌細胞的生長。此外，光神霉素在調節乳腺癌細胞耐藥性中也具有重要作用，乳腺癌耐藥蛋白（Breast cancer resistance protein,BCRP）是介導乳腺癌耐藥的蛋白之一，其啟動子區域含有多個Sp1結合位點，光神霉素能夠抑制Sp1與BCRP的結合進而抑制BCRP的激活[32]；同樣的，在乳腺癌干細胞中，光神霉素能夠通過阻斷Sp1與乳腺癌干細胞中的耐藥基因以及自我更新相關基因的啟動子結合，抑制這些基因的表達，使乳腺癌耐藥干細胞對細胞毒藥物多柔比星更加敏感[33]。

2.4.2 非甾體抗炎藥 非甾體抗炎藥托芬那酸的抗癌活性最先在胰腺癌中發現，主要通過抑制轉錄因子Sp1來抑制胰腺癌細胞的生長，隨后不斷有研究發現其同樣具有抑制結腸癌、肺癌、食管癌、乳腺癌生長的作用。在胰腺癌和結腸癌中，托芬那酸能夠增加Sp1、Sp3和Sp4的泛素化并以蛋白酶體依賴性的方式降解Sp1、Sp3和Sp4蛋白，進而抑制癌細胞的存活[34]。在乳腺癌中，托芬那酸能夠通過抑制人表皮生長因子2（human epidermal growth factor receptor 2，Her-2）的表達進而抑制BT474和SKBR3乳腺癌細胞和腫瘤生長[35]，而是否能夠通過靶向作用于Sp1來影響乳腺癌細胞生長的研究目前暫無報道。

2.4.3 天然藥物 樺木酸是在樹皮提取物中發現的天然三萜類化合物，樺木酸能夠通過下調Sp1蛋白和mRNA的表達水平來抑制BT474和MDA-MB-453乳腺癌細胞的生長并誘導其凋亡[36]。石榴提取物能夠降低乳腺癌細胞中Sp1 mRNA以及蛋白質表達的水平，同時也能夠降低涉及細胞增殖，血管生成和炎癥的Sp1調節基因，即CD1、Bcl2、VEGF及其受體VEGFR-1和核因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB），進而發揮了其在乳腺癌細胞中的抗增殖和促凋亡活性[37]。白花蛇舌草提取物通過ERα/Sp1介導p53激活，抑制乳腺癌的增殖并促進其凋亡[38]。甘草提取物甘草查耳酮A能夠通過抑制Sp1誘導人乳腺癌細胞凋亡，并降低生存素蛋白的表達水平[39]。2.4.4 Sp1與乳腺癌耐藥 Sp1除了影響乳腺癌的增殖和轉移之外，在乳腺癌耐藥的過程中也發揮重要作用。紫杉醇作為一種抗腫瘤藥物，已廣泛應用于多種上皮腫瘤（包括乳腺癌和宮頸癌等）的治療當中。然而，這種藥物的功效受到腫瘤細胞獲得性耐藥性的限制。Zhu等[40]的研究數據揭示了紫杉醇耐藥的新機制，其中Sp1介導的腫瘤壞死因子α誘導蛋白 1（tumornecrosisfactoralphainducedprotein1，TNFAIP1）上調有助于乳腺癌獲得對紫杉醇的耐藥性，并且表明Sp1-TNFAIP1軸可能成為一種新的治療癌癥的靶點。

Sp1是調節細胞周期、增殖以及轉移的關鍵轉錄因子，近年來關于Sp1的研究不斷取得突破性進展。在乳腺癌中，Sp1能夠廣泛的調節與乳腺癌發生發展相關的基因，如直接與細胞周期蛋白中的Sp1位點結合促進細胞周期蛋白的表達，進一步促進細胞的增殖；還能夠間接調控其他細胞因子的表達，如抑制Sp1的表達能夠減弱TGF-β誘導的乳腺癌細胞中EGFR的上調，進一步抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲。此外，SP1在乳腺癌細胞耐藥過程中也具有一定的作用，如抑制Sp1能夠增加乳腺癌干細胞對多柔比星的敏感性。各種化合物以及天然藥物通過抑制Sp1的活性來抑制腫瘤的生長也進一步證明了其在癌癥中的重要性，但目前文獻中所提到的觀點尚停留在基礎研究層面，這些靶向藥物在臨床上的應用情況鮮有報道。

綜上所述，基于Sp1調控基因的促癌活性以及對Sp1研究的不斷深入，我們有望以Sp1為乳腺癌治療靶點來尋求新的治療策略。但另一方面，目前尚未有以Sp1為靶點的藥物的臨床可行性、是否安全、是否會引起再次耐藥以及藥物之間的聯用是否會取得更好的治療效果的報道。因此，這一系列問題仍然值得我們今后進一步的研究和探索。