去泛素化酶USP9X促進消化系統腫瘤進展的研究現狀

王捷夫，王茜

細胞內蛋白質的表達水平受制于一系列程序的精密調控，其中一個重要環節就是翻譯后修飾水平的調節［1-2］。目前已經發現很多調控翻譯后修飾的蛋白在癌癥組織中異常表達，而這些蛋白質中很多成員已經成為癌癥治療的靶向分子［2-5］。其中去泛素化酶9X（ubiquitin specific protease 9X，USP9X）是十分具有代表性的成員之一，位列前500位“最低耐受性”變異的人類基因之一［6］，近年來也成為國內外的研究熱點。本文旨在對常見的消化系統惡性腫瘤的病理過程中USP9X發揮的作用進行論述和分析。

1 蛋白質泛素化和去泛素化酶

泛素化（ubiquitination）和去泛素化（deubiquitination）是細胞蛋白質翻譯后修飾的2 個重要調節方式。作為一種重要的蛋白質修飾形式，蛋白質泛素化在調控蛋白質穩定性方面起著重要作用［1-2］。泛素蛋白是一個由76 個氨基酸殘基組成的非常保守的多肽，其能在泛素激活酶（ubiquitinactivating enzyme，E1）、泛素結合酶（ubiquitinconjugating enzyme，E2）和泛素連接酶（ubiquitin ligase，E3）等一系列酶促反應催化下與細胞內靶蛋白上的1 個或多個賴氨酸殘基發生共價連接［7］。泛素蛋白本身也含有7 個賴氨酸殘基，因此它們之間也可以通過這些位點互相連接，形成多泛素蛋白鏈；如果多泛素蛋白鏈通過第48位賴氨酸殘基相連，靶蛋白會進入蛋白酶體而被降解［7］。

與乙酰化、磷酸化修飾類似，泛素化修飾也是可逆的，即可以通過去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）將泛素蛋白修飾物去除掉［2，8］。目前研究證實，細胞內廣泛存在多種去泛素化酶，這些不同類型的去泛素化酶均能水解底物蛋白上的泛素鏈之間的鏈接，對蛋白降解進行反向調節，從而影響蛋白質的功能［2］。去泛素化酶可以影響或調節細胞的生長發育、神經病變以及腫瘤發生等細胞生理或病理過程［2，9-10］。人類基因組能夠編碼近百種去泛素化酶。泛素特異性蛋白酶家族（ubiquitin specific proteases，USPs）是目前已知的去泛素化酶中成員最多、結構最具多樣性的一類去泛素化酶，亦屬于半胱氨酸蛋白酶類［11］。這些分子都含有1個泛素水解酶結構域，2個短而保守的片段，即賴氨酸盒和組氨酸盒，序列中具有起催化作用的三聯殘基，即半胱氨酸、組氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺，能將泛素分子從大的蛋白上移除［2，10］。近年來，去泛素化酶因對細胞周期調控、DNA 修復、染色質重塑等多種生物學過程的調節以及腫瘤發生過程中經常改變的信號轉導通路具有深遠的影響而受到廣泛關注。

2 USP9X概述

USP9X 是去泛素化酶的重要成員之一，其長度超過2 550個氨基酸，但目前對其蛋白質結構知之甚少。除了典型的半胱氨酸和組氨酸盒催化序列外，唯一可識別的結構域是N端末端的泛素樣的結構域（ubiquitin-like domain，UBL）。進化上，從果蠅到哺乳動物的USP9X蛋白序列顯示出顯著的保守性，而不同物種間序列的保守性反映了其在物種間的重要功能。USP9X同源物最先發現于果蠅的誘變篩選過程的脂肪基因faf，并被證明是合胞期胚胎發育和光受體命運測定的必需基因［5］。小鼠中Usp9x 的表達挽救了faf突變體所導致的眼睛和胚胎缺陷，進一步體現了從昆蟲到哺乳動物體內USP9X 的功能保守性。此外，在Usp9x 條件缺失性小鼠中表達人源USP9X 能夠去除神經元軸突的功能異常和遷移障礙。機制上，USP9X 可以從底物和包括 K48、K63 和K29在內的多種泛素鏈上裂解單泛素［12-13］。

近年來研究顯示，USP9X 可以通過穩定不同的底物影響不同生物學過程，如蛋白質運輸［14］、細胞凋亡［15］、極化［16］、自噬［17-18］、細胞生長及遷移［19-20］、免疫應答［21-22］和干細胞的自我更新及分化［23-24］。USP9X還能參與多條信號通路：USP9X是轉化生長因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）信號通路的重要組成部分；Smad4的519位賴氨酸單泛素化過程會阻礙Smad4 轉錄活性，而USP9X 能夠去除這一位點的泛素化；USP9X 能夠參與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的調控；USP9X 通過阻止活化的凋亡信號調節激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）的降解介導 ASK1 信號通路激活［25］。USP9X 在細胞內的定位也不盡相同，取決于細胞類型和細胞狀態。USP9X 一般存在于胞質和與膜相互作用的凹陷中［12-13，26］，也有研究發現其還能定位于特定結構，如高爾基體、核內體、線粒體，甚至能進入核內［27］。功能上，USP9X 基因變異與神經系統疾病有關。目前已報道USP9X在各種疾病，包括多種癌癥中異常表達：在低度漿液性卵巢腫瘤中，USP9X被鑒定為致癌候選基因之一［28］；在前列腺癌中，USP9X能夠穩定轉錄因子E-26 相關基因（E-twenty-six related gene，ERG），促進前列腺癌進展［29］；食管鱗癌和多發性骨髓瘤中USP9X 的高表達與腫瘤進展和預后不良有關［30-31］；在口腔鱗狀細胞癌中也發現了USP9X 的突變［32-33］；而在腦癌中，USP9X表達水平的降低抑制了腦腫瘤細胞的生存能力，提示USP9X在腦腫瘤中起致癌作用［34］。這些證據表明USP9X 可能發揮了促進癌癥進展的功能。然而，也有學者報道，USP9X在胰腺癌中通過限制鼠類肉瘤病毒癌基因K-ras癌基因（Kirsten-ras Proto-oncogene）誘導的細胞轉化從而抑制腫瘤侵襲性，與抑制癌癥有關［35］。可見根據癌癥的類型和分期不同，USP9X 在腫瘤中扮演的角色也不盡相同。

3 USP9X在消化系統腫瘤中的作用

3.1 USP9X 在食管癌中的作用 食管癌是第八大最常見的癌癥類型，在世界范圍內癌癥相關死亡率排名第6 位。食管癌的發病率在國際上各不相同，其中東亞及非洲的發病率最高。食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，農村發病率高于城市，且有一定的區域聚集性。近年來在我國整體發病率呈下降趨勢［36］。

Peng 等［30］收集了 102 對來自低度上皮內瘤變、高度上皮內瘤變和浸潤性食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者的正常及病變組織樣本，通過免疫組織化學染色發現食管從正常上皮、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變到浸潤性食管鱗狀細胞癌中USP9X 表達水平逐步增加，且最密集著色通常發生在食管上皮的基底層和前體病變的下棘層，提示該處最易發生惡變。USP9X的表達水平與浸潤深度和淋巴結轉移呈正相關，同時ESCC 患者USP9X 表達水平升高與生存率下降顯著相關；USP9X 表達上調在ESCC 癌前病變的形成和發展中起著重要作用，其表達水平與ESCC患者的生存密切相關，因此可作為ESCC的潛在生物標志物和預后預測因子。

3.2 USP9X 在胃癌中的作用 胃癌（gastric carcinoma，GCC）是全球最常見的癌癥之一，是癌癥相關死亡的第二大原因［37］。我國胃癌的發病率和死亡率均處于各種惡性腫瘤的前列［36］。多數患者就診時，腫瘤已處于Ⅲ期、Ⅳ期，雖經積極綜合治療，遠期療效仍令人沮喪。Fu 等［38］收集了 68例胃癌患者的正常組織與癌組織。通過免疫組化、免疫印跡等方法檢測了不同組織中USP9X 和Mcl-1（myeloid cell leukemia-1）的表達，發現USP9X在胃癌組織中的表達顯著高于正常對照組織；胃癌組織中USP9X表達與Mcl-1 表達呈正相關，與淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤分期呈顯著正相關，提示其作為癌基因的潛在意義，并且與較差的存活率顯著相關。為了解釋這一現象，利用USP9X 小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）轉染胃癌 AGS 細胞阻礙 USP9X 的表達，能夠顯著誘導胃癌細胞凋亡，并降低胃癌細胞的侵襲能力，提示USP9X可能是胃癌細胞凋亡和侵襲的關鍵調控因子［39］。

3.3 USP9X 在結直腸癌中的作用 結直腸癌在經濟發達地區和國家十分常見，一般為第2～4 位常見癌癥。隨著經濟的發展，生活方式發生改變，特別是飲食結構的改變，近年來發展中國家結直腸癌的發病率正在迅速上升［36］。

Peddaboina 等［40］通過對結腸癌樣本進行分析后發現，USP9X作為Mcl-1的去泛素化酶，與Mcl-1和B淋巴細胞瘤-xL（B-cell lymphoma-extra large，BclxL）在多數結腸腫瘤樣本中高表達并且共存，而Mcl-1和Bcl-xL的表達水平與臨床分期相關。體外實驗表明USP9X 的抑制劑WP1130 能促進Mcl-1 降解，與ABT-737 聯合應用顯示出化療的協同作用，促進多種結直腸腫瘤細胞的凋亡［31］。為了研究USP9X 在細胞應對抗癌藥物中的影響，Harris 等［41］利用同源重組獲得了USP9X基因座被破壞的癌細胞系，在一種廣泛用于治療結直腸惡性腫瘤的化療藥物——5-氟尿嘧啶的作用下，發現USP9X缺陷的癌細胞凋亡明顯增加，生存率顯著下降，提示降低USP9X表達可能增加癌癥細胞對某些常規治療藥物的敏感性。為了解結腸癌中USP9X 基因是否存在突變，Jo等［42］在79例結腸癌樣本中采用聚合酶鏈反應（PCR）和單鏈構象多態性（single strand conformation polymorphism，SSCP）方法檢測外顯子，發現USP9X 編碼序列單核苷酸重復序列A7 的移碼突變可能造成微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI）的結直腸癌。

與之相反，Khan等［43］發現USP9X能夠抑制結腸腫瘤的形成。該研究采用蛋白質組學鑒定出USP9X可以與F-Box 和WD 重復域蛋白7（F-Box And WD Repeat Domain Containing 7，FBW7）相互作用并去除其泛素化，因此USP9X缺失將導致FBW7不穩定；腸內缺乏Usp9x 的小鼠出現了分泌細胞分化減少，祖細胞增殖增加，與Fbw7表型相反；此外，USP9X失活將損害腸再生，并增加結腸炎相關性腸癌的腫瘤風險。因此該研究認為，USP9X通過調節Fbw7蛋白的穩定性來抑制腫瘤的形成。

3.4 USP9X 在肝癌中的作用 當前肝癌發病率我國居世界第1位，我國癌癥死因中肝癌居第2位。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占所有原發性肝癌的90%以上［36］。

有研究報道長鏈非編碼RNA（long noncodingRNA，lncRNA）LINC00473（LNC473）能夠參與肝腫瘤的進展。Chen 等［44］研究發現，LNC473 在肝癌組織中表達顯著升高，并且與較大的腫瘤體積、較高的BCLC 分期、血管浸潤和預后不良相關。LNC473可通過募集USP9X抑制生存素（Survivin）的泛素化，增加Survivin 的表達，從而促進肝癌細胞增殖和侵襲，并誘導上皮-間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）過程。另一研究結果表明，USP9X 在肝癌細胞 SMMC7721 和 HepG2 中表達上調，而抑制USP9X 表達后，Mcl-1 蛋白表達下降，誘導肝癌細胞凋亡，肝癌細胞的生長和遷移受到顯著抑制，因此，USP9X可能是肝癌治療和早期檢測的潛在靶點［45］。Liu等［46］研究發現，相較于抑癌基因p53表達缺失的肝癌細胞系Hep3B，具有p53表達的Huh7、HepG2 和SNU387 細胞系對傳統化療藥阿霉素和WP1130 聯合治療表現出更強的細胞增殖抑制，而 WP1130 正是通過抑制 USP9X 增強 HCC 細胞對阿霉素的化療敏感性。這個過程可能是通過抑制USP9X 從而加速了p53 降解，在肺癌中也有相似結果［47］。此外，USP9X 能夠通過 ASK1 促進肝癌細胞死亡。肝癌細胞系中糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）能夠通過抑制USP9X活性，增強ASK1 通過蛋白酶體途徑降解，最終抑制活性氧誘導的肝癌細胞死亡［48］。

3.5 USP9X 在胰腺癌中的作用 胰腺癌早期診斷困難，大多數患者在確診時已屬中、晚期，常常失去了手術根治機會，手術切除率一般在30%左右。即便是能手術切除的患者，其5年生存率也大約不到10%；至于未切除者，多數在半年內死亡，故該病的預后極差［36］。

在正常胰腺腺泡細胞中，USP9X 可以在影響自噬的促生存途徑中發揮作用。膜泡蛋白VMP1-USP9X-p62（Vacuole membrane protein-1）介導的噬菌作用是一種新型選擇性自噬途徑，可防止胰腺細胞死亡［17］。但在胰腺癌中，USP9X 的作用卻不甚明晰。一些研究者認為USP9X 能夠阻礙胰腺癌的進展：Pérez-Mancera 等［35］利用Sleeping Beauty（SB）轉座介導的插入突變在小鼠胰腺癌癌前病變模型中尋找與致癌基因K-ras（G12D）協同作用、加速腫瘤發生和進展的基因，篩選出包括USP9X在內的多個胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）的新候選基因。USP9X的缺失可以保護胰腺癌細胞免于失巢，并與Kras（G12D）協同作用，加速小鼠胰腺腫瘤的發生。該研究通過分析100例澳大利亞患者、42例美國患者及404例德國患者的PDA標本及其臨床數據，發現USP9X低表達與患者不良預后、低生存率呈正相關，與廣泛轉移呈負相關；此外，用曲古菌素A或5-氮雜-2'-脫氧胞苷可提高人PDAC 細胞系 USP9X 的表達，提示 USP9X 是 PDAC中具有預后和治療相關性的主要腫瘤抑制基因。Zhu等［49］報道在胰腺癌細胞株MIA PaCa-2、CFPAC-1、BxPC-3 和 AsPC-1 中，USP9X 能夠去除 Hippo 通路中大抑癌基因激酶2（Large tumor suppressor kinase 2，LATS2）上的泛素，而USP9X 的缺失激活了Yes 相關蛋白 1（Yes-associated protein，YAP），從而增強了細胞的致癌潛能。但另一方面，也有部分研究表明，USP9X 在PDAC 進程中充當致癌基因的角色：通過應用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（streptavidin-perosidase，SP）檢測30例老年患者手術切除的原發性胰腺癌組織及癌旁非腫瘤胰腺組織中USP9X的表達，發現胰腺癌組織中USP9X 表達顯著上升，并與有無淋巴結轉移及TNM分期顯著相關［50］。任澤強等［51］研究發現，在胰腺癌的發生、發展中，USP9X 能夠抑制Survivin 降解，Survivin 與USP9X 協同促進了胰腺癌的發生、發展，Survivin、USP9X 高表達的胰腺癌組織惡性程度更高，預后更差，此結果與其他研究者報道的在HCC中所得結果類似［44］。Liu 等［52］采用免疫組織化學染色法分析不同病理分級胰腺癌組織中USP9X 的表達。USP9X在胰腺癌組織中的表達顯著高于在鄰近的非腫瘤組織中的表達。下調內源性USP9X 表達可明顯抑制PANC-1 細胞的遷移和侵襲，促進細胞凋亡，并上調上皮標記物E-cadherin 的表達，下調Snail、Twist、N-cadherin、vimentin 等間質標記物和底物Survivin的表達水平。因此，USP9X可能通過促進EMT，促進PANC-1細胞的遷移和侵襲，抑制細胞凋亡，提示其在PDAC 的治療和預后中的重要潛在作用。

為了解釋USP9X 在PDAC 中作用的相互矛盾，Pal 等［53］利用建立的人胰腺腫瘤細胞系（PANC1 和MIAPACA2）和4個自發永生化的人胰腺患者源腫瘤（Patient-derived tumor Xenograft，PDX）細胞系進行了功能研究。USP9X 的過表達增加了PANC1 細胞的3D 生長和侵襲，并上調了已知的USP9X 底物Mcl-1 和瘙癢蛋白Itch（亦稱atrophin-1 interacting protein 4，AIP）的表達。在2D和3D培養中評價小分子去泛素酶抑制劑G9 對USP9X 活性的抑制作用發現，通過短發卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲除或 G9 處理抑制 USP9X 可降低 Mcl-1 和 Itch 蛋白水平，減少PANC1和PDX細胞系的3D集落形成，誘導MIAPACA2細胞快速凋亡。但在由胰腺腫瘤模型的基因工程小鼠胰腺癌細胞系中，G9不能影響細胞3D生長，對小鼠體內異位種植的腫瘤生長亦無明顯影響。Cox 等［54］通過在 5 個 PDAC 細胞系（BxPC3、Capan1、CD18、Hs766T 和 S2-013）中降低 USP9X 的表達，發現細胞錨定依賴型生長受到抑制。而在BxPC3 和 Capan1 細胞中，USP9X 還能夠影響細胞非錨定依賴型生長。此外，USP9X 還能改變部分細胞的細胞周期分布及侵襲能力。利用USP9X 抑制劑WP1130 都能夠顯著地誘導這些細胞的細胞毒性。該研究認為，USP9X 的功能和作用高度依賴于周圍環境。因此，USP9X 可能是治療晚期PDAC 的一個有前途的治療靶點。

為了進一步明確USP9X 能否作為腫瘤治療中的靶點，Ma等［55］研究了體外胰腺細胞系和小鼠異種移植模型，在探究USP9X在吉西他濱耐藥中作用時發現，USP9X 在胰腺癌細胞中的表達與吉西他濱耐藥呈正相關，而去泛素化酶抑制劑WP1130 對USP9X的作用使胰腺癌細胞對吉西他濱敏感。抑制劑WP1130 抑制了吉西他濱誘導的自噬作用，而阻斷自噬作用則消除了WP1130對胰腺癌細胞吉西他濱的致敏作用。因此，吉西他濱和WP1130 聯合治療通過抑制體內自噬增強吉西他濱的抗腫瘤作用，為胰腺癌中吉西他濱的耐藥性提供了新的認識。

4 結語

USP9X 的異常表達對于腫瘤的形成、發展有著重要的作用，且其表達水平與腫瘤臨床及病理特征的密切關聯，與腫瘤患者的預后緊密相關，臨床上也許可以通過對USP9X 蛋白表達水平的檢測來評估腫瘤患者的預后或指導進一步治療。然而也要清楚地認識到，在體外培養細胞中，USP9X既可能促進細胞凋亡，又可以促進細胞存活，這與其在不同種類、狀態中的細胞或腫瘤中相互作用或占優勢的底物有著密不可分的聯系，因此對于理解其在癌癥中的潛在作用有著復雜的可能性。