嬰幼兒配方乳粉中菌相的構成與分析

◎ 楊 光，趙 平，郭瑩瑩,丁松喬，王哲明，張 媛，李興霖，宋連寶

（1.黑龍江省質量監督檢測研究院，黑龍江 哈爾濱 150028；

2.國家農業標準化監測與研究中心（黑龍江），黑龍江 哈爾濱 150028））

全世界都在倡導母乳喂養，但在嬰兒不能食用母乳或母乳不能滿足其生長需求的情況下，嬰幼兒配方乳粉是其必須選擇的營養來源。嬰幼兒配方乳粉的質量好壞與嬰幼兒的健康和生長發育息息相關。近年來，致病微生物引起的嬰幼兒疾病有阪崎腸桿菌引起的新生兒腦膜炎、小腸結腸炎和茵血癥，患兒死亡率高達50%。此外，沙門氏菌感染會對免疫力較低的嬰幼兒等有嚴重影響，甚至導致其死亡[1-2]。

目前，GB 10765-2010《食品安全國家標準 嬰兒配方食品》中關于致病菌的限制僅限于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和阪崎腸桿菌。基于工作積累，除這3項致病菌外，嬰幼兒配方乳粉中還存在其他種類的條件致病菌[1-2]。本文主要對嬰幼兒配方乳粉中的細菌進行篩選與鑒定，對進一步的監管提供有價值的數據。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料

不同廠家生產的不同批次的嬰幼兒配方乳粉（600批次），一次性無菌平皿，一次性無菌吸管，無菌均質袋，一次性無菌接種環，一次性無菌涂布棒。

1.2 實驗試劑與培養基

革蘭氏染色液，平板計數瓊脂，結晶紫中性紅膽鹽瓊脂，BGLB肉湯，緩沖蛋白凍水，四硫磺酸鈉煌綠增菌液基礎（TTB），亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC），沙門氏菌顯色培養基，阪崎腸桿菌顯色培養基，亞硫酸鉍瓊脂（BS），Baird-Parker瓊脂基礎，凍干血漿，李氏增菌肉湯（LB，LB），李斯特氏菌顯色培養基平板，PALCAM瓊脂平板，甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂（MYP），改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（mLST），三糖鐵瓊脂，營養瓊脂（NA），0.1%煌綠溶液，碘液，50%卵黃液，多粘菌素B，亞碲酸鉀卵黃增菌液，萬古霉素（Vm），萘啶酮酸，吖啶黃素，頭孢他啶。

實驗中所用培養基的配制與滅菌，均按培養基的配制說明，試驗用水為GB/T 6682-2008所規定的一級水。所用培養基與試劑均按GB 4789.28-2013的要求進行驗證且符合要求[6]。

1.3 實驗儀器

高壓蒸汽滅菌器，潔凈工作臺，生物安全柜，重力稀釋儀，電子天平，恒溫水浴振蕩器，拍擊式均質器，生化培養箱，菌落計數儀，光學顯微鏡及成像系統，全自動微生物生化鑒定系統系統。

所用儀器均為經過計量部門檢定校準的儀器，并按時進行維護與期間核查。

2 實驗方法

2.1 嬰幼兒乳粉中微生物污染情況[3-5]

2.1.1 菌落總數檢驗[7]

2.1.1.1 樣品的準備與接種培養

把樣品充分搖晃混勻，無菌操作稱取25 g置無菌均質袋中加入225 mL無菌磷酸鹽緩沖液，用拍擊式均質器拍打2 min，制成1∶10的樣品勻液。

用無菌吸管吸取樣品勻液1 mL，加入無菌平皿內，做兩平行。同時吸取1 mL稀釋液，做空白對照。及時將15 mL的冷卻至46 ℃菌落計數瓊脂培養基傾注平皿，轉動平皿使其混合均勻。36 ℃倒置培養48 h。

2.1.1.2 菌落計數

用菌落計數器記錄各平皿上的菌落總數，以CFU·g-1表示。具體計數與計算方法參照GB 4789.2-2016中的規定。結果以CFU·g-1計。

2.1.2 大腸菌群的檢驗[8]

2.1.2.1 樣品的準備與接種培養

把樣品充分搖晃混勻，無菌操作稱取25 g置無菌均質袋中加入225 mL無菌磷酸鹽緩沖液，用拍擊式均質器拍打2 min，制成1∶10的樣品勻液。

用無菌吸管吸取樣品勻液1 mL，加入無菌平皿內，做兩平行。同時吸取1 mL稀釋液，做空白對照。

及時將15 mL的冷卻至46 ℃的VRBA培養基傾注平皿，轉動平皿使其混合均勻，待凝固后，再加5 mL VRBA覆蓋平板表層。36 ℃倒置培養24 h。

2.1.2.2 菌落的選擇與證實試驗

選取菌落數在15～150 CFU之間的平板，計數平板上的典型可疑菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環，菌落直徑為0.5 mm或更大。

從VRBA平板上選取不同類型的典型可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內，36 ℃培養48 h，觀察產氣情況。產氣者為大腸菌群陽性。

2.1.2.3 結果計數

經證實為大腸菌群陽性者，按GB 4789.3-2016規定進行計數，結果以CFU·g-1計。

2.1.3 沙門氏菌檢驗[9]

2.1.3.1 增菌

把樣品充分搖晃混勻，無菌操作稱取25 g置于盛有225 mL的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打2 min，36 ℃培養 8 h。

輕輕搖動培養過的樣品混合物，移取1 mL，轉接于10 mL TTB管中，于42 ℃培養24 h，另移取1 mL，轉接于10 mL SC管中，于36 ℃培養24 h。

2.1.3.2 分離

用一次性無菌接種環取增菌液一環，劃線接種于BS瓊脂平板與沙門氏菌顯色平板，分別于36 ℃培養48 h與24 h，觀察結果。沙門氏菌在BS瓊脂平板上菌落形態為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養基不變；在沙門氏菌顯色平板上呈紫色菌落。

2.1.3.3 鑒定

自選擇性瓊脂平板上選擇典型可疑菌落，接種營養瓊脂（NA）平板，36 ℃培養24 h。選擇單菌落進行革蘭氏染色確定菌株的革蘭氏陰性或陽性，選擇GN鑒定卡或GP鑒定卡，利用全自動微生物生化鑒定系統進行鑒定。

2.1.4 金黃色葡萄球菌定量檢驗[10]

2.1.4.1 樣品的準備與接種培養

把樣品充分搖晃混勻，無菌操作稱取25 g置無菌均質袋中加入225 mL無菌磷酸鹽緩沖液，用拍擊式均質器拍打2 min，制成1∶10的樣品勻液。

吸取1 mL樣品勻液，以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量分別加入三塊Baird-Parker平板，然后用無菌涂布棒涂布整個平板，注意不要觸及平板邊緣，靜止10 min后，倒置36 ℃培養48 h，觀察結果。

2.1.4.2 菌落計數與確認

金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2～3 mm，顏色呈灰色至黑色，有光澤，常有淺色的邊緣，周圍有不透明的沉淀環，其外常有一清晰帶。當用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感。

選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板，且3個平板所有菌落數合計在20～200 CFU之間的平板，計數典型菌落數。

從典型菌落中選取5個可疑菌落進行血漿凝固酶試驗，確定是否為金黃色葡萄球菌，并按GB 4789.10-2016規定計算結果。結果以CFU·g-1計。

2.1.5 阪崎腸桿菌檢驗[11]

2.1.5.1 增菌

把樣品充分搖晃混勻，無菌操作稱取100 g置含有900 mL已滅菌的緩沖蛋白胨水中，使其充分溶解，36 ℃培養 18 h。

移取1 mL轉種于10 mL的mLST-Vm肉湯中，44 ℃培養 24 h。

2.1.5.2 分離培養

搖勻mLST-Vm肉湯培養物，分別取培養物1環劃線接種于兩塊阪崎腸桿菌顯色培養基平板上，36 ℃培養24 h，觀察結果。

2.1.5.3 鑒定

選取阪崎腸桿菌顯色培養基平板上的典型可疑菌落，劃線接種于NA平板，36 ℃培養24 h，用全自動微生物生化鑒定系統進行鑒定。

2.1.5.4 結果表述

綜合菌落形態與生化鑒定結果，以100 g樣品中檢出或未檢出阪崎腸桿菌計。

2.1.6 單核細胞增生李斯特是菌檢驗[12]

2.1.6.1 增菌

把樣品充分搖晃混勻，無菌操作稱取25 g置于含有225 mL的LB1增菌液的均質袋中，拍擊式均質器拍擊2 min，30 ℃培養24 h，移取0.1 mL,轉種于10 mL LB2增菌液內，30 ℃培養24 h。

2.1.6.2 分離

取LB2增菌液劃線接種于李斯特顯色平板和PALCAM瓊脂平板，36 ℃培養48 h，觀察結果。典型菌落在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；在李斯特顯色平板上為藍綠色菌落，周圍有一不透明白色暈圈。

2.1.6.3 鑒定

選取平板上的典型可疑菌落，劃線接種于NA平板，36 ℃培養24 h，用全自動微生物生化鑒定系統進行鑒定。

2.1.6.4 結果表述

綜合菌落形態與生化鑒定結果，以25 g樣品中檢出或未檢出單核細胞增生李斯特氏菌計。

2.1.7 蠟樣芽孢桿菌的檢驗[13]

2.1.7.1 樣品的準備與接種培養

把樣品充分搖晃混勻，無菌操作稱取25 g置于盛有225 mL無菌磷酸鹽緩沖液的均質袋中，拍擊式均質器拍打2 min制成1∶10的樣品勻液。

以0.3、0.3、0.4 mL的接種量分別移至3塊MYP瓊脂平板中，用無菌涂布棒涂布整個平板，注意不要觸及平板邊緣，靜止10 min后，倒置30 ℃培養48 h，觀察結果。典型菌落為微粉紅色，周圍有白色至淡粉紅色沉淀環。

2.1.7.2 鑒定

選取平板上的典型可疑菌落，用全自動微生物生化鑒定系統與根狀生長試驗和蛋白質毒素結晶試驗進行鑒定。

2.1.7.2.1 全自動微生物生化鑒定系統

選取平板上的典型可疑菌落，接種NA平板36 ℃培養24 h，選取單菌落進行鑒定。

2.1.7.2.2 根狀生長試驗

挑取單個典型可疑菌落按間隔2～3 cm劃平行直線接種于干燥1 d的NA平板上,30 ℃培養48 h，觀察結果。蠟樣芽孢桿菌呈粗糙山谷狀生長特征，蕈狀芽孢桿菌呈根狀生長特征。

2.1.7.2.3 蛋白質毒素結晶試驗

挑取純培養的單個典型可疑菌落接種于硫酸錳營養瓊脂平板上，30 ℃培養24 h，并于室溫放置3 d，挑取培養物少許于載玻片上，滴加蒸餾水混勻并涂成薄膜。經自然干燥，微火固定后，加甲醇作用30 s后傾去，再通過火焰干燥，于載玻片上滴滿0.5%堿性復紅，放火焰上加熱持續1 min，移去火焰，再更換染色液再次加溫染色30 s，傾去染液用潔凈自來水徹底清洗、晾干后鏡檢。觀察有無游離芽胞（淺紅色）和染成深紅色的菱形蛋白結晶體。除蘇云金芽胞桿菌外，其他芽胞桿菌不產生蛋白結晶體。

2.1.7.3 結果計算

選擇已鑒定確認為蠟樣芽孢桿菌的平板，且3個平板上所有菌落總數合計在20～200 CFU，計數典型菌落，按GB 4789.14-2014規定計算結果，結果以CFU·g-1計。

2.2 不同形態微生物的分離純化與鑒定

在以上不同微生物檢驗實驗中，不同種類的選擇培養基上生長多種不同類型的典型可疑菌落。將可疑菌落進行分離純化，接種于NA平板，36 ℃培養24 h，革蘭氏染色鑒定其形態特征后，用全自動微生物生化鑒定系統進行生化鑒定。

3 結果與分析

3.1 嬰幼兒配方乳粉微生物污染情況

經過對600批次不同品牌的嬰幼兒配方乳粉中菌落總數的檢驗，結果菌落總數大多集中在10～100 CFU·g-1的數量，占總檢驗數量的42.67%；＜10 CFU·g-1的樣品數量占37.0%，100～1 000 CFU·g-1的樣品數量占17.67%，1000～10 000 CFU·g-1的樣品數量占2.0%，而＞100 000 CFU·g-1的樣品數量僅占0.67%，說明產自的嬰幼兒配方乳粉的微生物污染能夠很好的控制在GB 10765規定的微生物污染限量指標內。存在微生物污染風險的樣品依然存在，占檢驗樣品總量的3%，生產廠家應分析問題找出污染原因，堅決杜絕微生物污染風險的存在。結果見表1。

表1 菌落總數檢驗結果與分布情況表

3.2 嬰幼兒配方乳粉大腸菌群污染情況

對600批次不同品牌的嬰幼兒配方乳粉進行大腸菌群的檢驗，結果600批次樣品均未有大腸菌群的生長，VRBA平板上沒有菌落的生長。說明各生產廠家有效的控制了大腸菌群的污染，能夠讓消費者放心購買。結果見表2。

表2 菌落總數、大腸菌群、蠟樣芽胞桿菌檢驗結果及分布情況表

3.3 嬰幼兒配方乳粉沙門氏菌污染情況

對600批次不同品牌的嬰幼兒配方乳粉中沙門氏菌進行檢驗，結果600批次的樣品經增菌、分離、鑒定等實驗均為檢出沙門氏菌，檢出率為0%，但在檢驗過程中個別品牌樣品的沙門氏顯色平板與BS平板上有可疑菌落生長，經全自動微生物生化鑒定系統鑒定非沙門氏菌。說明樣品在生產運輸過程中還是受到了一定程度的污染，需嚴格控制。要分析污染原因，生產無潛在風險的家長放心的嬰幼兒配方乳粉。結果見表3。

表3 沙門氏菌、阪崎腸桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌檢驗結果及分布情況表

3.4 嬰幼兒配方乳粉金黃色葡萄球菌污染情況

經過對600批次不同品牌的嬰幼兒配方乳粉中金黃色葡萄球菌的檢驗，結果600批次樣品中金黃色葡萄球菌的檢出率為0%，樣品中金黃色葡萄球菌均為＜10 CFU·g-1。有個別品牌的樣品在Baird-Parker平板上生長可疑菌落，但經鑒定非金黃色葡萄球菌，為其他陽性球菌。可能為生產加工環節造成的污染，也會存在潛在風險，生產廠家需進一步排查原因，解決潛在的風險。結果見表2。

3.5 嬰幼兒配方乳粉阪崎腸桿菌污染情況

對600批次不同品牌的嬰幼兒配方乳粉進行阪崎腸桿菌檢驗，經增菌、分離、鑒定等實驗，結果有兩個品牌的14個批次的樣品檢出了阪崎腸桿菌，檢出率為2.33%，且此兩種品牌的檢出樣品均為2014年以前生產的樣品，此后均為檢出。未檢出阪崎腸桿菌的個別品牌樣品在增菌、分離后阪崎腸桿菌顯色平板上有可疑菌落生長，全自動微生物生化鑒定系統鑒定非阪崎腸桿菌，為其他腸桿菌科細菌。說明某些生產廠家的樣品純在著較大的風險，檢出的應立即召回、銷毀，并要求分析污染原因，控制污染源，堅決杜絕不合格產品流向市場。未檢出而有可疑菌落生長的產品，生產廠家同樣要找出污染原因，包括生產環節與運輸環節，人員、設備等均要排查。力爭生產百姓放心健康的合格產品。結果見表3。

3.6 單核細胞增生李斯特氏菌污染情況

600批次的不同品牌嬰幼兒配方乳粉經增菌、分離、鑒定等實驗，結果樣品中均為檢出單核細胞增生李斯特氏菌。個別品牌的某些樣品在檢驗過程中的李斯特顯色平板與PALCAM平板上有可疑菌落生長，但經全自動微生物生化鑒定系統鑒定均非單核細胞增生李斯特氏菌，而是其他李斯特氏菌。雖然未檢出單核細胞增生李斯特氏菌，但是依然存在著有機會危害嬰幼兒身體健康的細菌，需要加以關注，找出污染原因，消滅污染源生產放心產品。結果見表3。

3.7 蠟樣芽孢桿菌污染情況

對600批次不同品牌嬰幼兒配方乳粉進行檢驗，結果在少數MYP平板上有可疑菌落生長，但經全自動微生物生化鑒定系統與根生長試驗和蛋白質毒素結晶試驗鑒定，結果均非蠟樣芽孢桿菌，而是其他芽孢桿菌。說明這些品牌的有些產品依然受到芽孢桿菌的污染，依然會給嬰幼兒的健康帶來危害，需要引起生產廠家的注意，排查污染環節，生產無污染的嬰幼兒配方乳粉。結果見表3。

3.8 不同形態微生物的分離純化與鑒定

在對600批次不同品牌嬰幼兒配方乳粉進行微生物污染進行檢驗時，在其致病菌的檢驗過程中，在不同的選擇性培養基平板上分離到了很多株典型的可疑菌落，雖非致病性目標菌株，但可能為條件致病菌。對各菌株進行分離、純化、鑒定，得出所分離得到的非目標菌的信息，得到了嬰幼兒配方乳粉中細菌菌相的構成及分布。結果共分離得到266株細菌，并對266株細菌進行分離、純化、革蘭氏染色，利用全自動微生物生化鑒定系統與其他鑒定手段進行鑒定，共鑒定出31種細菌，其中嬰幼兒配方乳粉沙門氏菌檢驗過程中選擇性培養基平板上的可疑菌落較多，且經鑒定后均為非沙門氏菌，其中泛菌屬的檢出率高，且很多其他菌株為機會致病菌，必須得到關注。結果見表4。

表4 可疑菌落生化鑒定結果表

4 總結

嬰幼兒配方乳粉的生產工藝較為復雜，殺菌、濃縮工序容易出現質量問題，殺菌不徹底造成細菌總數過高，導致最終產品微生物超標；設備清洗不徹底、設備故障等，均容易導致產品大腸菌群和雜質超標。并且嬰幼兒配方乳粉中營養成分豐富，極其利于微生物的生長繁殖。一旦出現上述質量問題，將對嬰幼兒的生長發育及身心健康造成不利影響。而大多數情況下，安全監管者在嬰幼兒配方乳粉的生物安全監測方面處于相對被動的局面。

本項目主要對黑龍600批次不同品牌的嬰幼兒配方乳粉的微生物污染情況進行分析，包括菌落總數、大腸菌群、致病菌的檢驗，在菌落總數的檢驗過程中得出各品牌的嬰幼兒配方乳粉的菌落總數控制的較好，僅有0.67%的樣品不合格，2.0%的樣品存在不合格的風險。大腸菌群的檢驗結果顯示所有檢驗樣品均為受到大腸菌群的污染。在致病菌的檢驗過程中，在分離時選擇性平板上有可疑菌落生長，但只有阪崎腸桿菌檢出，說明對阪崎腸桿菌的污染控制不到位，需要查明污染原因，并堅決杜絕此類產品的出現。

沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽孢桿菌均為未檢出，但也存在選擇性平板上有可疑菌落生長的情況，對可疑菌落進行分離、純化、利用全自動生化鑒定系統對分離得到的細菌進行鑒定，最終共鑒定出31種細菌，得到了該批嬰幼兒乳粉中細菌菌相的構成及分布。

本實驗通過系統地對嬰幼兒配方乳粉中的微生物進行富集培養，菌種分離，菌種鑒定，再對菌種鑒定結果進行分析統計，全面了解了嬰幼兒配方乳粉中的菌落分布與構成，對嬰幼兒配方乳粉的質量監督與監測和企業的自行監督具有指導意義，并為檢測標準的制定提供有力的參考，更為改變監管的被動局面提供充分的理論依據。