發酵環境變化對酵母生長和成品啤酒的影響

崔云前，吳梓萌，蘇文超，張海夢

（齊魯工業大學 生物工程學院 山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南 250353）

啤酒是人類古老的酒精飲料，歷史悠久，隨著科學技術的提高以及人們對啤酒工藝的不斷探求，釀酒師們已經掌握了啤酒發酵過程的生化機理，但酵母代謝過程復雜并且發酵過程中可以改變的工藝參數眾多，如麥汁濃度、發酵溫度設置、壓力參數等。啤酒發酵過程中采取的釀造工藝將直接或間接影響到成品啤酒中的高級醇、酯、雙乙酰等風味物質。所以了解啤酒發酵過程中的變量因素，優化酵母的生長環境，可以有效控制發酵進程，本文選取了幾個主要的變量因素，對現有的研究進行了綜述，以期為啤酒工業生產提供理論參考。

1 麥汁濃度

麥汁營養成分豐富，為酵母細胞提供了良好的生存環境，糖類物質約占麥汁浸出物的90%，酵母利用麥汁中的可發酵糖產生代謝產物乙醇和二氧化碳，同時形成一系列發酵副產物，如醇類、醛類、酯類、酮類和硫化物等物質[1]。酵母進行有氧呼吸，麥汁中糖度快速下降，酵母生長繁殖結束后，糖度下降趨勢呈現平穩狀態，有研究發現[2]，初始糖度12°P的麥汁，啤酒主發酵周期為4～6 d，發酵完成后的小麥主發酵液糖度值為4～5°P。

1.1 滲透壓力

當酵母接種到一定濃度的麥汁后，會受到滲透壓力，滲透壓是在由半透膜隔開兩種濃度不同的溶質時產生的力。酵母細胞可以根據滲透壓力改變自身體積的大小，在高滲環境下，減少細胞體積；在低滲環境下，增加細胞體積。PRATT P L等[3]將酵母暴露于20 g/100 mL的山梨糖醇溶液15 min后，利用掃描電子顯微鏡進行觀察，與對照組表面光滑的酵母細胞相比，處理過的酵母細胞發生收縮，存在外包膜的褶皺和內陷，同時發現愛爾菌株釀酒酵母（Sac charomyces cerevisiae）、比拉格菌株巴斯德酵母（Saccha romyces pastorianus）對滲透脅迫的耐受性更大。ZHUANG S W等[4]提出，隨著麥汁濃度增加，酵母細胞膜流動性受到影響，為了應對滲透壓力的改變，會產生丙三醇和海藻糖，保護細胞內可溶性酶并且對細胞膜穩定性起作用。

麥汁滲透壓隨著稀釋原麥汁濃度而降低，但乙醇和丙三醇的滲透壓在較高濃度下會增加，因此乙醇是發酵過程中影響滲透壓的主要因素。

1.2 乙醇脅迫

以初始糖度為18°P的麥汁為典型，得到的成品啤酒中含7.5%vol的酒精。先前的研究表明[5]，應用高濃度釀造技術釀造傳統的渾濁啤酒（opaque beer）時，啤酒中的酒精濃度為4.74%vol，與標準發酵條件下記錄的產酒精濃度相比，高出了2.66%vol。根據ERTEN H等[6]的研究，利用高濃度麥汁進行釀造時，每單位的可發酵浸出物產生更多的乙醇，這個工藝需要使用無氧水進行下游稀釋步驟來調節成品啤酒中浸出物/乙醇的含量[7]。

因此，使用高濃度麥汁進行釀造時，應定期監控乙醇含量[8]，乙醇含量較高，應相應地補充發酵液營養條件，如金屬離子（鋅、鎂、鈣）、脂質和酵母營養[9]。

1.3 麥汁濃度對酵母生長和成品啤酒的影響及解決措施

在過去50年左右的時間里，提高釀造和蒸餾的效率已經成為釀造和蒸餾行業的一個主要焦點[8]。可以提高生產效率的高濃釀造順勢而生，高濃度釀造是利用高于標準濃度的麥汁進行釀造，為了增強啤酒的穩定性，后期用去氧水對啤酒進行稀釋處理[10]。通過這種方式，提高了生產需求，節省能源，而不會從根本上擴大釀造、發酵和貯存設備，啤酒口味更加順滑[6]。

JANE M M等[11]選取12～20°P的麥汁進行啤酒釀造，發現與正常濃度的麥汁（12°P）相比，發酵96 h后，高濃度釀造時的殘余可溶性固形物含量較高，會導致啤酒中有不可接受的甜味。高濃度釀造啤酒仍然存在的問題是啤酒泡沫穩定性不好，STEWART G G[12]對20°P與10°P麥汁進行研究，從滿鍋麥汁到成品啤酒，監測其中的疏水性多肽，發現高濃度麥汁（20°P）在發酵過程中大量損失疏水性多肽，發酵結束只有50 mg/L，將高濃度釀造得到的啤酒稀釋至酒精含量4.5%vol，疏水性多肽含量不到低濃度啤酒（10°P）的50%。

高濃度麥汁釀造時產生的酯類含量更高，主要為乙酸乙酯和乙酸異戊酯，這與LIMA L等[7，13-14]的研究結果一致，啤酒中的果香和丁香花味更突出。利用高濃度麥汁進行釀造時，采取分批通風，接種酵母時增加麥汁中的溶解氧含量，促進了酵母生長，一定程度上降低了酯含量[15]。發酵溫度也可以加速高濃度發酵，LIMA L等[7]通過試驗證實溫度增加至18 ℃，酵母接種率增加至22×106CFU/mL，可以使22°P和15°P的麥汁發酵時間相同。STEWART G G[8]提出，當酵母接種到高濃度麥汁（＞16°P）后，利用亞甲基藍染液對酵母細胞進行活力鑒定，發現酵母細胞活力下降，這與ZHUANG S W等[4]的研究結果一致。酵母長期處于高濃度乙醇、CO2和不同濃度滲透壓的環境中，對酵母有毒害作用[16]，使酵母的生長代謝受到抑制，酵母使用代數明顯降低，這與PRATT P L等[3，17]的研究結果一致。高濃釀造中補充8種氨基酸（蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸）可以顯著提高麥汁發酵度，促進酵母生長[18]。

此外，麥汁濃度是影響發酵度的關鍵因素，發酵度是酵母消耗麥汁中浸出物的量與原麥汁浸出物總量的比值。釀造高發酵度（70%以上）的啤酒時，麥汁濃度越低，乙醇生成量減少，感官品評后發現啤酒口味越寡淡，風味物質生成量減少[19]。在現代啤酒廠，通過發酵高濃度麥汁來縮短發酵時間并且增加產量，麥汁濃度高低對酵母吸收營養物質并進行生長代謝都具有重要影響[20]。

2 接種率對酵母生長和成品啤酒的影響

酵母接種率對發酵速度影響極大，需根據酵母種類、麥汁濃度、發酵溫度等因素來確定，以添加酵母后使麥汁快速起發為準[15]。傳統啤酒廠發酵時正常酵母接種率為20×106CFU/mL。

VERBELEN P J等[21]在實驗室條件下將拉格菌株接種到15°P麥汁中，發現2～3代酵母發酵時，將酵母接種率增加4倍可以縮短發酵時間，這是因為高接種率比起正常接種率的細胞，初始階段細胞密度高所以對發酵環境的適應能力較強，發酵時間縮短[22]。增加接種率，發酵旺盛，酵母吸收氨基酸能力增強，形成有機酸和CO2以及酵母細胞分泌H+多，得到的成品啤酒中pH較低[22]。

RODMAN A D等[23]對啤酒釀造過程進行動態仿真與可視化分析，發現接種率較低會引起發酵副產物雙乙酰和乙酸乙酯濃度較高，VERBELEN P J等[22]提出，隨著發酵進行，任何酵母接種率下檢測到的雙乙酰含量都是升高的，當可發酵糖消耗50%以后，接種率為1×107～2×107CFU/mL時，檢測到雙乙酰含量開始下降，但接種率為4×107～12×107CFU/mL時，產生雙乙酰一直在增多，僅在糖消耗70%～80%后才呈現下降趨勢。酵母發酵2代后，接種率正常的酵母細胞，啤酒中雙乙酰維持在穩定值（0.26 mg/L），接種率高，啤酒中雙乙酰含量比較高，但對酵母進行充氧，可有效減少啤酒中雙乙酰含量[21]。KUCHARCZYK K等[14]提出接種量（5×106～7×106CFU/mL）較低時，改變酵母接種率對整個工藝中乙醛的平均含量沒有顯著的統計學影響，當麥汁中酵母接種量從7×106CFU/mL增加至9×106CFU/mL，乙醛濃度發生了可比較的降低，VERBELEN P J等[22]也證實了這個結論。對于1代酵母，接種率高產生的高級醇含量較多，主要是異丁醇和異戊醇濃度增加，而隨著酵母使用代數增加，接種率高低產生高級醇含量差異不明顯[21]。酵母接種率不同，細胞凈生長量（最多酵母細胞數與最初接種率的差值）不同，但乙醇產量是相同的，這與RODMAN A D等[23]的研究一致，但劉麗艷[24]研究提出，接種率較高乙醇產生較多。VERBELEN P J等[21]提出與正常酵母接種率相比，接種率提高4倍對乙酸乙酯、乙酸異戊酯和己酸乙酯有消極影響。乙酸異戊酯在接種率為40×106CFU/mL時有最大生成量，己酸乙酯沒有明顯產量趨勢[22]。酵母接種率從5×106CFU/mL增加至7×106CFU/mL乙酸乙酯的生成量沒有改變，但是接種量進一步增加，從7×106CFU/mL增加至9×106CFU/mL，酯濃度顯著增加了10%[14]。

發酵結束時，發現較高接種率（20×106～120×106CFU/mL）比起較低接種率（10×106CFU/mL），酵母細胞活力顯著下降，表明發酵時間較長對細胞活力有消極影響[22]，VERBELEN P J等[21]的研究也證實了這個觀點。

在高接種率發酵時，酵母細胞的凈生長量下降，對接下來幾代酵母的生理學穩定性有不利影響。因此，需要應用不同的O2條件，如麥汁充氧和對發酵液充氧，這對酵母生理和高細胞密度發酵下啤酒風味物質的穩定至關重要。

3 發酵溫度對酵母生長和成品啤酒的影響

發酵過程的溫度會嚴重影響酵母生長和代謝速率，隨著發酵開始，需要隨時監控發酵罐內的溫度，在加速發酵的同時確保酵母特性沒有改變并且發酵副產物的產量不會損害成品啤酒的風味。麥汁開始發酵之前，需要保證滿罐溫度和發酵開始的溫度一致，一般麥汁的滿罐溫度比主發酵溫度低3～4 ℃[25]。

拉格菌株發酵溫度在6～15 ℃，發酵時間大約在一周（160 h）；愛爾菌株發酵溫度較高在18～25 ℃，發酵時間較短為3～4 d。比起拉格菌株，愛爾菌株的代謝狀態對溫度變化更敏感，一般發酵溫度較高會加快麥汁中可發酵糖的消耗率，游離氨基氮含量會增多，促進酵母細胞生長和增殖，減少發酵時間并增加啤酒生產效率；溫度較低可以防止細菌污染并賦予啤酒獨特的口感和香氣，但會導致酵母發酵活力降低[26]。為了應對發酵溫度的變化，酵母細胞會快速地調整自身的代謝狀態[27]，改變酵母生長率、發酵速率并形成代謝物。RODMAN A D等[23]提出，發酵過程中的溫度會嚴重影響酵母生長和代謝速率，只要發酵環境維持在30 ℃以下并且酵母細胞不受損害，溫度越高發酵速度越快。超過這個臨界溫度，酒精和揮發性風味物質嚴重損失，同時產生不受歡迎的物質，細菌生長增加。

當原麥汁濃度相同時，主發酵溫度對發酵速度影響較大，主發酵溫度越高，發酵速度越快[28]。YU Z M等[26]的研究發現，發酵溫度從15 ℃變化至10 ℃時，拉格菌株和愛爾菌株的發酵時間分別延長了33.33%和100%，發酵溫度較低，葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖等糖代謝活力降低，糖酵解關鍵酶如己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的最大反應速率下降，酵母細胞生長和增殖變得遲緩。提高發酵溫度，酵母生長繁殖加快，高級醇生成增加，特別是芳香醇，如β-苯乙醇、酪醇、色醇[15]。高溫發酵對酯形成有利，當發酵溫度從12.5 ℃升至25 ℃，乙酸乙酯濃度增加了60%，乙酸異戊酯增加30%[15]。發酵溫度為17～22 ℃，20 ℃時啤酒穩定性和品質較好[24]，WEBERSINKE F等[29]也提出，在20 ℃進行發酵時，水果香氣、酒精、酸度和酒體呈現最佳值，硫味和腐敗味最淡。

在發酵過程中要保證麥汁發酵溫度始終如一，只有穩定的發酵溫度才能確保酵母生長和發酵速度一致。

4 壓力對酵母生長和成品啤酒的影響

在啤酒釀造過程中，酵母菌株懸浮在發酵液中進行發酵活動，在發酵結束后，酵母菌株遵循自身獨特的釀造特性，拉格菌株絮凝物沉積到錐形發酵罐錐底[30]，從錐底排出酵母進行回收；愛爾菌株的絮凝物與CO2結合上升到啤酒表面[31]，國外的發酵罐多為敞口發酵罐，可在啤酒表面進行回收，但國內發酵罐多為封閉式發酵罐，回收愛爾菌株時多在降溫后絮凝物沉積到錐底進行回收。在啤酒工業生產中，啤酒發酵罐的體積較大，加上液位壓差和發酵過程產生的CO2，同一發酵罐中不同部位的酵母受到的壓力不同。對于大型發酵罐來說，罐內壓力有時可達0.3 MPa[32]。

一般來說，最高控制罐壓為發酵溫度除以100，罐壓越高，啤酒中溶解CO2越多。在發酵過程中，增加麥汁高度會加大靜止液壓，CO2濃度增加，酵母生長繁殖受到影響，發酵速率降低，壓力上升也會抑制酯和高級醇的生成，所以保持一定高度的麥汁很有必要[25]。對比常壓（0.1 MPa）培養的酵母，加壓培養（0.3 MPa、0.5 MPa、1.0 MPa）酵母到達對數生長期的時間推后，持續時間會縮短，并且衰亡期會提前到來，酵母產二甲基硫的能力下降，雙乙酰合成和還原都受到影響[32]，啤酒中絕大多數的揮發酯和高級醇都是在主發酵期間形成，乙醛作為乙醇的前體物質，在主發酵前期大量產生[15]，酵母細胞受到一定壓力，細胞內各種酶活力會下降，抑制酯類物質和高級醇的代謝，揮發酯和高級醇生成量會減少，乙醇脫氫酶活力下降造成乙醛不能被還原為乙醇[33]，成品啤酒中乙醛含量超過閾值。另有研究[34]指出，保持一定壓力發酵對酵母增殖有積極作用，可以降低發酵液中蛋白酶A含量，從而減少啤酒中泡沫活性蛋白的降解，可以促進啤酒維持一定的泡持性。

發酵過程中產生的壓力會影響酵母的正常代謝活動，酶代謝能力下降，影響揮發性風物物質的生成和還原，最終影響成品啤酒的風味。但是，隨著人們追求生產效率，發酵設備逐漸變得大型化，壓力將是人們不可忽視的影響因素之一。

5 結論

在實際生產釀造中，應不斷調整工藝，根據啤酒廠定義的產品目標，對存在的問題進行有效控制，可以通過犧牲低優先級的工藝目的提高發酵效率，如適當提高發酵溫度，在縮短發酵時間的同時卻適度降低了乙醇含量和乙酸乙酯濃度，并在可容許范圍內增加了雙乙酰濃度[35]；隨著麥汁濃度的增加，有必要成比例地增加酵母接種率[10]并優化溫度條件；發酵罐罐壓會影響酵母的狀態和活力，外觀發酵度70%以上，適當增加發酵罐罐壓（0.10 MPa升至0.14 MPa），雙乙酰還原加快[36]。此外，也應該根據啤酒自身發酵特點選育合適的酵母。