固態發酵食醋中污染菌的控制研究綜述

程 曄

（貴陽味莼園食品股份有限公司，貴州 惠水 550601）

引起固態發酵食醋產品在貨架期間出現黏稠性沉淀物、產氣、醋液呈不同程度的渾濁和發黏，嚴重的還會使產品產生惡臭的污染菌膜很難殺滅和根除。受這種雜菌污染的產品只要出現一批，就會使數批甚至數年，每年春末到初秋時段的醋產品受到影響。這種情況并非個例而是存在于絕大多數固態發酵食醋生產企業，危害極大。

對于引起食醋在貨架期產氣、渾濁、有異味等變質現象的研究已超過20年，參與研究的有工廠、高校、科研院所。研究中被企業廣為采納的結論是[1-3]：生醋應及時加熱滅菌；最終醋產品的滅菌法采用高溫一次滅菌法或二次滅菌法；加強生產過程的衛生管理，防止交叉污染。

目前研究中存在不足的是不能準確地解釋食醋發酵生產中僅在夏季高溫時節出現腐敗現象；沒有一個適用性強、準確、快速的檢測方法及生產全過程的有效控制方法，食醋釀造行業內研究者難以從中獲得一致性指導建議。

1 固態發酵食醋中菌膜的傳統認知

肉眼觀察到的固態發酵食醋中的膜狀物，形態像醋蛾子或紅茶菌膜的碎塊。醋蛾子中最主要的成分是膠膜醋酸桿菌，也就是醋酸菌。紅茶菌膜是多種醋酸菌、酵母菌和乳酸菌組成的“共生菌落”[4-5]。用醋蛾子釀醋法在民間由來已久，其中醋蛾子的主要成分是膠膜醋酸桿菌。膠膜醋酸桿菌又名膜醋酸菌、木醋酸菌，也是紅茶菌中厚膜的主要成分。這種菌膜在釀制白醋工業中也有應用。

1.1 醋蛾子在表面發酵法釀制白醋生產中的應用

釀造食醋生產工藝分為固態發酵與液態發酵兩大類，液態發酵釀醋工藝中又分為表面發酵法、淋澆發酵法、深層發酵法和固定化菌體連續發酵法。其中表面發酵法生產白醋[6]是在敞口容器中置醋種（上批的成熟醋），加入體積分數3%的酒液及少量營養物質，蓋上缸蓋，在自然氣溫或在30 ℃左右的保溫室內自然發酵，此時醋酸菌在液面上形成一層菌膜。

日本最普遍采用的釀醋方法[7]按發酵形式可分為靜置式和通氣式兩種。靜置式釀醋法以米醋制法為例，米飯加曲糖化后進行酒精發酵，再加入醋酸菌、醋化桿菌等菌培養的醋母，在方形罐中靜置發酵3～4 d，液面形成一層菌膜，開始生成醋酸。

1.2 釀造食醋的滅菌方法

食醋的pH值為2.8～3.8，屬高酸食品，只要總酸≥3.5 g/100 mL，食醋中微生物80 ℃、10 min加熱滅菌即可達到要求。即便是污染菌膜，鑒于對食醋中污染菌膜的傳統認知，認為這種菌膜是醋酸菌、酵母菌和乳酸菌的共生菌，其致死溫度和時間為50～65 ℃、10 min，食醋的常規滅菌溫度和時間為80 ℃、10 min，是能達到GB 2719—2018《食醋衛生標準》和GB18187—2000《釀造食醋》中微生物指標要求的。

1.3 企業對固態醋酸發酵中污染菌膜的微生物檢測方法

取變質醋樣采用傳統的增殖培養，將增殖培養的菌液用傾注法接種于不同的平板培養基中，進行厭氧或好氧培養，觀察培養基上的菌落形態特征，再經染色法和顯微鏡法，結合《伯杰氏細菌鑒定手冊》[8]進行初步分類，分析判斷污染細菌的種屬，進而推斷出該類菌的生長和致死條件。

產品出廠的食醋微生物檢驗均按照GB 4789.1—2016《食品微生物學檢驗總則》、GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》和GB/T4789.22—2003《食品微生物學檢驗調味品檢驗》微生物檢驗方法標準執行。

1.4 傳統認知對食醋中污染菌膜的檢驗與控制的不適用性

（1）實踐證明巴氏滅菌法不能殺滅食醋中污染菌膜。

（2）傳統的微生物分離鑒定法不僅耗時長，而且在培養基上很難得到疑似單一菌株，也就無從進一步進行其生長特性及致死條件的試驗。

（3）采用食品安全國家標準中的微生物檢驗方法，檢驗已變質的醋樣，結果仍無法判斷變質醋的微生物指標不合格。檢驗結果一般均符合GB 2719—2003《食醋衛生標準》和GB 18187—2000《釀造食醋》中微生物指標要求。其中菌落總數幾乎都≤100 CFU/mL，遠低于標準規定的≤10 000 CFU/mL。

2 固態發酵食醋中污染菌的研究

由于傳統認知對食醋中污染菌的檢驗與控制方法的不適用性，食醋中引起黏度增加、產氣、變質、拉絲、產膜的污染菌對釀醋行業的危害長期存在，一直是企業質量控制中的一個難題。這個課題也引起了高校及科研院所的關注，課題研究報告不少，但研究結論不一致，缺乏指導性結論。

2.1 固態發酵食醋被雜菌污染的關鍵生產環節研究

馬凈麗等[1，3]研究得出，生醋的長時間存放是引起污染菌的主要原因。通過對生產現場了解，車間在固態醋酸發酵生產過程中，確有生醋長時間存放的現象，由于固態醋酸發酵工藝所決定，生醋中還原糖和氨基酸等營養物豐富，并有少量殘留乙醇，在存放過程中，存活的微生物中部分耐酸厭氧菌，利用其營養物質在醋液底部至中上部繼續繁殖，耐酸好氧菌或兼性好氧菌則可在表面繁殖，其中的產酸菌可將醋液中的糖轉化為酸，單從以產酸含量判斷原料利用率，短時表象有益無害，可多批生醋連續存放后，難免就形成了與雜菌共生而變異的醋蛾子。由于現在具有一定規模的食醋生產企業，待配兌或待滅菌的生醋都是存放在容積幾十至上百立方米的大罐中，進罐出罐的醋對液面的沖擊，可在罐底找到像醋蛾子或紅茶菌膜碎塊的膜狀物，醋液發黏、有納豆的拉絲。

2.2 引起固態發酵食醋發黏、產氣變質的微生物菌屬研究

對于食醋中微生物污染菌的研究，分離鑒定的方法不同，樣品的差異，研究結果也不一致。在9個研究報告中，得出導致食醋腐敗變質的污染菌有8種不同的結論：鑒定為芽孢桿菌（Bacillus）2例；鑒定為類芽孢桿菌（Paenibacillus）1例；鑒定為葡糖桿菌屬（Gluconobacter）1例；鑒定為牛痘乳桿菌（Lactobacillus vaccinostercus）1例；鑒定為耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）1例；鑒定分別為特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）、腐生葡萄球菌（Staphalococcus saprophyticus）、頭狀葡萄球菌（Staphylococcus capitis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）1例；鑒定分別為枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）1例；鑒定為引起腐敗現象的致腐微生物是以穩定群落的形式存在1例。

2.2.1 采用傳統分離鑒定方法判定污染菌的研究

王建云等[2]對發黏、劣變的食醋采用常規平板培養法37 ℃厭氧培養48 h，鏡檢后判定污染菌為芽孢桿菌。成劍鋒[3]對變質食醋中的膜狀物洗液，采用肉胨培養基30 ℃室溫培養，對單一菌落進行芽孢染色、鞭毛染色后鏡檢，接觸酶試驗，再對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，初步判定為污染菌為類芽孢桿菌屬。張懷敏等[9]對導致老陳醋產氣微生物的分離和鑒定中得到1株革蘭氏陽性菌，經產氣性、生理生化試驗，并根據《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏系統細菌學手冊》判斷得出，產氣菌株為芽孢桿菌。薛建華等[10]通過液體富集培養、平板涂布及劃線的方式，結合驗證試驗，從食醋中分離出絮狀物的產生菌，初步鑒定為葡糖桿菌屬。

2.2.2 采用傳統分離鑒定方法與16S rDNA 序列分析方法判定污染菌的研究

孫文麗等[11]從脹氣食醋中分離到6株細菌，經鑒定分別為貝萊斯芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌、腐生葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、枯草芽孢桿菌。且各菌株均可在糖發酵培養基中產生白色絮狀物沉淀，其中1株菌能產生氣體，是造成食醋脹氣的主要潛在微生物。曹晉宜等[12]通過傳統培養與16S rDNA 序列同源性分析方法，并結合微生物宏基因組分類測序方法得出了引起食醋發黏的微生物主要是牛痘乳桿菌的結論。翟磊等[13]采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術以及純培養技術，得到導致食醋變質污染菌株，通過分子生物學分析鑒定污染菌為耐酸乳桿菌。趙爽等[14]從產膜醋中分離的菌株，進行形態學特征和16S rDNA鑒定，結果證實，引起食醋產膜的菌株為木葡糖醋酸桿菌和巴氏醋桿菌。楊榮杰[15]根據形態特征觀察及生理生化鑒定結果，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》、《常見細菌系統鑒定手冊》中對芽抱桿菌的特征描述進行初步分類；16S rDNA序列測定與分析結果表明，枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌可以導致食醋產膜、變渾濁。范曉軍[16]利用Illumina HiSep高通量測序技術，對山西老陳醋夏冬兩季不同發酵階段的細菌菌群構成及演替進行深入分析，首次發現引起食醋腐敗現象的致腐微生物以穩定群落的形式存在。

2.2.3 研究得出引起變質的污染菌中多數是固態醋酸發酵中的常見菌

有關文獻報道[17-20]，乳酸菌、醋酸菌是主要的食醋釀造微生物，芽孢桿菌也是固態醋酸發酵中的常見菌。在多個地區的固態醋酸發酵醋醅中分離出巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌。研究表明[20-23]，芽孢桿菌是固態醋酸發酵過程中的重要微生物，芽孢桿菌在其體內不僅存在糖酵解途徑，而且存在三羧酸循環的氧化代謝途徑，其中間代謝產物如檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸的存在，可以緩解揮發性醋酸的刺激氣味。凝結芽孢桿菌在生長過程中可以產生乳酸，對食醋提高風味也是必不可少的[24-25]。固態開放式發酵過程中復雜的微生物代謝賦予了固態發酵食醋獨特的風味及口感，但是對復雜微生物群落的釀造功能及其調控方法尚缺少深入了解。

2.3 固態發酵食醋中污染菌的檢驗方法研究

研究中采用國家標準檢驗法對已變質的食醋樣品微生物檢測，菌落總數幾乎為0。當采用血球計數版顯微鏡觀察計數時，活動菌≥106CFU/mL，不活動菌也≥106CFU/mL，其中多為桿菌和短桿菌。國家制定的食品安全國家標準《食品微生物學檢驗總則》、《食品微生物學檢驗菌落總數測定》和《食品微生物學檢驗調味品檢驗》檢驗方法標準已不適用于食醋出廠檢驗。

張繼忠等[26-27]對我國食品微生物檢測技術的分析中也證實了這個論點，國家制定的檢測標準方法已經無法很好地適應當前的實際檢測需求，在這一背景下，必須要提高檢測技術的創新突破。

在2.2中引起固態發酵食醋發黏、產氣變質的微生物菌屬研究中，已介紹了研究中所采用的檢測方法。無論何種方法，首先得采用傳統的分離鑒定法得到單一菌株。可是在企業的驗證試驗中，即便是已經出現發黏、渾濁、產氣的食醋樣品，都很難獲得疑似菌落，因為某些微生物物種難以培養和分離，并且完全依賴于微生物的表型性狀也會導致錯誤的識別[28-30]。

2.4 固態發酵食醋中污染菌的控制方法研究

對污染菌實施控制的是企業，要制定一套完整、有效的生產全過程控制方法，主要依據是污染菌的定性、定量檢測結果。準確的檢測結果又必須建立在可信的檢驗方法上，鑒于目前雖有許多新技術在微生物檢測上的成功應用報道，但都還是研究層面上的，尚無企業適用的檢驗方法。只能采用生醋應及時加熱滅菌；最終醋產品的滅菌法采用高溫一次滅菌法或二次滅菌法；加強生產過程的衛生管理，防止交叉污染的研究結論[1，3]。對目前防止固態發酵食醋產品貨架期出現發黏、產氣、渾濁等質量問題起到一定作用。

3 結論與展望

綜上所述，目前對固態發酵食醋中污染菌的研究，初步認定可能導致固態發酵食醋發黏、產氣、渾濁的污染菌是以穩定群落的形式存在，其中的菌屬有醋酸菌、乳酸菌、芽孢桿菌等。

這些菌在固態發酵食醋中對食醋的理化、風味質量是有益的。也正因為發酵過程中微生物的多樣性，在生醋中存活的微生物也是多樣性的，如果不及時滅菌存放，在營養豐富的液態低pH值環境下是否會產生變異，聚集形成危害食醋產品的雜菌菌膜，尚待深入研究。

上述研究對食醋生產一線的傳統認知起到了一定的警示作用，杜絕了生醋的長時間存放，采用高溫滅菌或二次滅菌法取代了傳統巴氏滅菌法，加強生產過程的衛生管理，防止交叉污染。

存在的不足是研究結論不一致，食醋釀造行業內研究者難以從中獲得一致性指導建議。研究中介紹的檢驗方法還停留在研究層面，沒有一個對企業適用性強、準確、快速的檢測方法及生產全過程的有效控制方法。

在今后的研究中綜合各種食品微生物檢驗新技術的優勢，不斷優化組合，研究出更快、更方便、更靈敏的固態發酵食醋中污染菌的檢測標準。