穿心蓮內酯對大鼠心肌肥厚作用的影響

李棠

【摘要】 目的：觀察穿心蓮內酯抗大鼠心肌肥厚的作用。方法：選取出生1～3 d的Wistar乳鼠32只，體外培養新生Wistar大鼠的心室肌細胞，于培養的第3天，換成無血清培養基繼續培養24 h，然后隨機分為正常對照組、PTH組（PTH 10-7 mol/L）、PTH+穿心蓮內酯組（穿心蓮內酯10-5 mol/L）、PTH+穿心蓮內酯+MVA組（MVA 10-4 moL/L），每組8只。穿心蓮內酯預先孵育1 h，PTH及MVA均孵育24 h。分析PTH對心肌細胞直徑、3H-亮氨酸（Leu）摻入率、單個細胞蛋白含量、心房利鈉肽（ANP）、B型利鈉肽（BNP）含量的影響;分析穿心蓮內酯對肥大心肌的保護作用;分析MVA對穿心蓮內酯的拮抗作用;分析各組對心肌細胞K-Ras、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達量的影響。結果：PTH組心肌細胞直徑明顯大于正常對照組，3H-Leu摻入率、單個細胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均高于正常對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;PTH+穿心蓮內酯組心肌細胞直徑明顯小于PTH組，3H-Leu摻入率、單個細胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均低于PTH組，差異均有統計學意義（P<0.05）;PTH+穿心蓮內酯+MVA組心肌細胞直徑明顯大于PTH+穿心蓮內酯組，3H-Leu摻入率、單個細胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均高于PTH+穿心蓮內酯組，差異均有統計學意義（P<0.05）。設正常對照組上述指標的相對表達量均為1，PTH組K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相對表達量均明顯高于正常對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;PTH+穿心蓮內酯組K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相對表達量均明顯低于PTH組，差異均有統計學意義（P<0.05）;PTH+穿心蓮內酯+MVA組K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相對表達量均高于PTH+穿心蓮內酯組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：10-5 mol/L穿心蓮內酯能有效抑制心肌細胞肥大，同時還能抑制K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達，使用MVA后能使K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達再次增加。

【關鍵詞】 心肌細胞 心肌肥厚 穿心蓮內酯

[Abstract] Objective： To observe the anti-cardiac hypertrophy effect of Andrographolide. Method： Thirty-two Wistar rats were cultured for 1-3 d. The ventricular myocyte of newborn Wistar rats were cultured in vitro. On the third day of culture， the cells were cultured for 24 h and then randomly divided into four groups， 8 rats in each group： normal control group， PTH group （PTH 10-7 mol/L）， PTH + Andrographolide group （Andrographolide?10-5 mol/L）， PTH + Andrographolide + MVA group （MVA 10-4 moL/L）. Andrographolide was pre-incubated for 1 h， PTH and MVA were incubated for 24 h. The effects of PTH on cardiac myocyte diameter， incorporation of 3H-leucine （Leu）， protein content of single cell， ANP and BNP were analyzed， the protective effect of andrographolide on hypertrophic myocardium was analyzed， the antagonistic effect of MVA on Andrographolide was analyzed， the effect of intervention factors on the expression of K-Ras， ERK1/2 and p-ERK1/2 protein in cardiomyocyte were analyzed.Result： The diameter of myocardial cells in PTH group was significantly larger than that in normal control group， the 3H-Leu incorporation rate， the content of protein in single cell， ANP and BNP in PTH group were higher than those in normal control group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the diameter of myocardial cells in PTH + Andrographolide group was significantly smaller than that in PTH group， the 3H-Leu incorporation rate， the content of protein in single cell， ANP and BNP in PTH + Andrographolide group were lower than those in PTH group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the diameter of cardiomyocyte in PTH + Andrographolide + MVA group was significantly larger than that in PTH + Andrographolide group， the 3H-Leu incorporation rate， the content of protein in single cell， ANP and BNP in PTH + Andrographolide + MVA group were all higher than those in PTH + Andrographolide group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The expression levels of K-ras， ERK1/2 and p-ERK1/2 were all 1， the relative expression of K-ras， ERK1/2 and p-ERK1/2 in PTH group were significantly higher than those in normal control group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the relative expression of K-ras， ERK1/2 and p-ERK1/2 in PTH + Andrographolide group was significantly lower than those in PTH group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the relative expression of K-ras， ERK1/2 and p-ERK1/2 in PTH + Andrographolide + MVA group were higher than those in PTH + Andrographolide group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： 10-5 mol/L Andrographolide can effectively inhibit cardiomyocyte hypertrophy， and can inhibit the expression of K-Ras， ERK1/2 and p-ERK1/2 proteins. The expression of K-Ras， ERK1/2 and p-ERK1/2 protein were increased again after MVA.

[Key words] Cardiomyocyte Myocardial hypertrophy Andrographolide

First-authors address： The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.36.006

甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）是一種重要的中分子尿毒癥毒素，其在體內蓄積可對心血管系統造成多種損害，可引起血壓升高、心血管鈣化、心律失常、心肌肥厚甚至猝死等改變，是尿毒癥心血管病變的主要因素之一[1]。因此，積極探索其防治措施具有重要的臨床意義[2]。大量研究表明穿心蓮內酯除具有降血脂作用外，還具有抑制心肌肥厚和心臟保護的功能，但其機制尚不十分清楚。本研究以新生大鼠原代培養的心室肌細胞為研究對象，以大鼠PTH1-34作為肥大誘導劑建立心肌細胞肥大模型，觀察穿心蓮內酯對肥大心肌細胞的影響，探討穿心蓮內酯可能的保護機制?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 大鼠甲狀旁腺1-34（rat parathyroid hormone 1-34，rPTH1-34，美國Sigma公司）、左旋甲羥戊酸內酯（MVA，美國Sigma公司）;穿心蓮內酯（大連輝瑞制藥有限公司）;3H-亮氨酸（3H-Leu，北京原子能研究所）;小鳥苷酸三磷酸結合蛋白（small GTP-binding protein，Ras）K亞基（K-Ras）、細胞外信號調節激酶12（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）、磷酸化（p）ERK1/2一抗（美國SantaCruz公司）;大鼠心房利鈉肽（ANP）及B型利鈉肽（BNP）ELISA檢測試劑盒（美國SantaCruz公司，批號20081125）[3]。

1.2 心肌細胞的原代培養 取出生1～3 d的Wistar乳鼠（32只）心尖部分，冷PBS緩沖液（pH值7.4）沖洗2次，剪碎至1 mm3，0.25%胰酶37 ℃水浴消化5 min，反復消化5～6次。將收集的細胞懸液過濾后，1 000 r/min離心10 min，取沉淀以10%血清DMEM重新懸浮，進行Percoll非連續密度梯度離心，最后加入10-4 mol/L的5-溴脫氧尿核苷抑制成纖維細胞的生長。倒置顯微鏡下觀察細胞形態和搏動，待融合成單層細胞時開始實驗[4]。

1.3 分組 于培養的第3天，換成無血清培養基繼續培養24 h，然后隨機分為四組：正常對照組、PTH組（PTH 10-7 mol/L）、PTH+穿心蓮內酯組（穿心蓮內酯10-5 mol/L）、PTH+穿心蓮內酯+MVA組（MVA 10-4 moL/L），各8只。穿心蓮內酯預先孵育1 h，PTH與MVA均孵育24 h。

1.4 單個心肌細胞直徑的測定 細胞經不同處理后，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，Motic Images Advanced 3.0軟件（Micro Optic Industrial Group CO.，LTD）測量經過細胞核的最小直徑為心肌細胞直徑，每組隨機選取5個視野，每個視野計數20個細胞[5]。

1.5 觀察指標 （1）分析PTH對心肌細胞直徑、3H-Leu摻入率、單個細胞蛋白含量、ANP、BNP含量的影響，其中3H-Leu摻入率檢測心肌細胞蛋白合成速率，BCA法測定單個細胞蛋白含量，ELISA法檢測ANP、BNP濃度的變化;（2）分析穿心蓮內酯對肥大心肌的保護作用;（3）分析MVA對穿心蓮內酯的拮抗作用;（4）分析各組干預因素對心肌細胞K-Ras、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達水平的影響，均采用Western Blot方法測定。

1.6 統計學處理 使用SPSS 18.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌細胞直徑、3H-Leu摻入率、單個細胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量比較 各組心肌細胞直徑、3H-Leu摻入率、單個細胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;PTH組心肌細胞直徑明顯大于正常對照組，3H-Leu摻入率、單個細胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均高于正常對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;PTH+穿心蓮內酯組心肌細胞直徑明顯小于PTH組，3H-Leu摻入率、單個細胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均低于PTH組，差異均有統計學意義（P<0.05）;PTH+穿心蓮內酯+MVA組心肌細胞直徑明顯大于PTH+穿心蓮內酯組，3H-Leu摻入率、單個細胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均高于PTH+穿心蓮內酯組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1和圖1。

2.2 各組心肌細胞K-Ras、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的相對表達量比較 設正常對照組上述指標的相對表達量均為1，PTH組K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相對表達量均明顯高于正常對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;PTH+穿心蓮內酯組K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相對表達量均明顯低于PTH組，差異均有統計學意義（P<0.05）;PTH+穿心蓮內酯+MVA組K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相對表達量均高于PTH+穿心蓮內酯組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

PTH是由甲狀旁腺主細胞和嗜酸細胞分泌的含有84個氨基酸的直鏈多肽，在調節鈣平衡中發揮了重要的作用。各種原因導致的甲狀旁腺功能亢進均可引起血中PTH水平的升高。研究表明，心肌細胞上存在PTH1型受體，提示心臟是PTH的靶器官之一[6]。進一步的研究發現，高水平的盯H與心肌肥厚有關，胛H能在體外誘導大鼠心室肌細胞發生肥大反應[7]。因此本實驗使用PTH作為肥大誘導劑建立了心肌細胞肥大模型，旨在探索PTH致心肌肥厚的防治。心肌細胞屬于終末分化細胞，不具備增殖能力，當細胞發生肥大反應時，表現為細胞體積增大、蛋白含量增加和間質增生[8]。心肌肥大時ANP和BNP代償性增加，是公認的特征性變化指標。因此筆者在實驗中以細胞直徑、3H-Leu摻入率、單個細胞蛋白含量、ANP和BNP含量作為衡量心肌細胞肥大的指標[9]。本研究結果顯示，PTH組心肌細胞直徑明顯大于正常對照組，3H-Leu摻入率、單個細胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均高于正常對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），提示心肌細胞發生了肥大反應，模型建立成功[10]。穿心蓮內酯分子量最小、活性最強、不良反應最輕，因此，本實驗中選用穿心蓮內酯作為心肌肥厚的保護劑[11]。本研究結果顯示，PTH+穿心蓮內酯組心肌細胞直徑明顯小于PTH組，3H-Leu摻入率、單個細胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均低于PTH組，差異均有統計學意義（P<0.05），說明穿心蓮內酯能有效地抑制肥大反應的發生，對肥大心肌具有保護作用。有關穿心蓮內酯抑制心肌肥厚的具體機制還不十分清楚。一部分研究認為可能與其上調PPARα、γ、下調AT1和TLR4 mRNA、抑制ERK1/2的活化等有關，大多數研究則認為與其阻斷甲羥戊酸通路和小GTP蛋白活性有關，最近的研究還發現穿心蓮內酯通過抑制Ras-ERK途徑抑制心肌肥厚[12-13]。本研究結果顯示，PTH組K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相對表達量均明顯高于正常對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;PTH+穿心蓮內酯組K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相對表達量均明顯低于PTH組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結果提示心肌肥厚時Ras和ERK1/2蛋白活化，使用穿心蓮內酯后Ras和ERK1/2蛋白表達減少，結合既往研究的結果：ERK1/2的活化參與了PTHH致心肌肥厚的發生，提示穿心蓮內酯可能通過抑制ERK1/2的活性從而抑制心肌肥厚的發生。ERK1/2是多種信號轉導途徑的連接點，受多種信號的調控[14-15]。為了進一步證實Ras蛋白在穿心蓮內酯抑制心肌肥厚中的作用及其與ERK1/2的調控關系，使用MVA進行干預。羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶是MVA合成的限速酶，MVA通路在細胞生長過程中發揮了重要作用[16-17]。Samala等[18]證實，隨著心肌肥厚的發展，膜結合的Ras含量逐漸增加，磷酸化MAPK亦增加。穿心蓮內酯能減少Ras活性及膜結合含量，減少磷酸化MAPK含量，進而減少p-MHCQ403轉基因家兔心肌肥厚的進程[19-20]。本實驗結果顯示，PTH+穿心蓮內酯+MVA組心肌細胞直徑明顯大于PTH+穿心蓮內酯組，3H-Leu摻入率、單個細胞蛋白含量、ANP含量、BNP含量均高于PTH+穿心蓮內酯組，差異均有統計學意義（P<0.05）;PTH+穿心蓮內酯+MVA組K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的相對表達量均高于PTH+穿心蓮內酯組，差異均有統計學意義（P<0.05）。說明抑制Ras能有效抑制ERK1/2蛋白的表達和心肌肥厚的發生，即穿心蓮內酯可能通過抑制Ras-ERK1/2途徑從而抑制了心肌肥厚反應。此外，使用MVA后沒有完全對抗穿心蓮內酯的抗肥大作用，提示穿心蓮內酯可能還通過其他途徑發揮抗肥大作用，還有待于進一步的研究。

綜上所述，10-5 mol/L穿心蓮內酯能有效抑制心肌細胞肥大，同時還能抑制K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達，使用MVA后能使K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達再次增加。

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（收稿日期：2019-10-31） （本文編輯：程旭然）