新生大鼠松果體細胞體外分離培養及增殖情況觀察

韓星 馮星

【摘要】 目的：分離培養并鑒定新生大鼠松果體細胞，觀察其體外增殖情況。方法：選擇30只新生SD大鼠，處死后分離松果體組織，采用多聚賴氨酸對培養板予預包被處理胰酶消化、經差速貼壁分離等方法，對新生大鼠松果體細胞進行體外分離培養并傳代。觀察50 d內體外培養的松果體細胞的形態變化，培養7 d時采用免疫熒光法，觀察原代松果體細胞5-羥色胺（5-HT）及微管相關蛋白-2（MAP-2），實時定量PCR法檢測N-乙酰基轉移酶（AANAT）及生長抑素（SS）mRNA。分別取傳代第1、3、5代對數生長期細胞測定細胞增殖情況。結果：新生大鼠松果體細胞呈圓球形或多角形，培養21 d時松果體細胞體積明顯增大，胞質內可見深色細小囊泡狀顆粒。培養7、14、21、28 d時，隨培養時間延長，松果體細胞AANAT mRNA的相對表達量逐漸降低（P<0.05），松果體細胞SS mRNA的相對表達量先升高后降低（P<0.05）。細胞傳代后第1、3代細胞生長曲線近似“S”形，且第3代細胞增殖最為旺盛;隨傳代次數增加，第5代細胞生長曲線近似平緩，細胞逐漸衰老、死亡。結論：采用胰酶消化、差速貼壁分離等方法并結合含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基培養，可獲得純度較高且有增殖潛力的大鼠松果體細胞，細胞在體外增殖活躍，且具有一定的生物學功能。

【關鍵詞】 松果體細胞 五羥色胺 微管相關蛋白-2 N-乙酰基轉移酶 生長抑素 細胞增殖

[Abstract] Objective： To isolate， culture and identify the pineal cells of newborn rats and observe their proliferation in vitro. Method： A total of 30 newborn SD rats were selected， the pineal tissue was separated after death， the pineal cells of newborn rats were cultured and subcultured in vitro by the methods of trypsin digestion and separation by differential attachment. The morphological changes of pineal cells cultured in vitro within 50 days were observed， after 7 days of culture， 5-hydroxytryptamine （5-HT） and microtubule associated protein-2 （MAP-2） were observed by immunofluorescence， the mRNA of N-acetyltransferase （AANAT） and somatostatin （SS） were detected by real-time quantitative PCR. The first， third and fifth generations of logarithmic growth cells were collected and the cell proliferation was measured. Result： The pineal cells of the newborn rats were round or polygonal， after 21 days of culture， the volume of pineal cells increased significantly， and dark vesicular granules were seen in the cytoplasm. At the 7th， 14th， 21st and 28th day of culture， with the prolongation of culture time， the relative expression of AANAT mRNA decreased gradually （P<0.05）， and the relative expression of SS mRNA increased first and then decreased （P<0.05）. The growth curve of the first and third generation cells was similar to “S” shape， and the third generation cells had the most vigorous proliferation， with the increase of subculture times， the growth curve of the fifth generation of cells was almost smooth， and the cells gradually aged and died. Conclusion： By using trypsin digestion， differential attachment separation and DMEM/F12 medium containing 10% fetal bovine serum， rat pineal cells with high purity and potential for proliferation can be obtained. The cells proliferate actively in vitro and have certain biological functions.

[Key words] Pineal gland cells 5-HT MAP-2 AANAT SS Cell multiplication

First-authors address： Childrens Hospital of Soochow University， Suzhou 215000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.36.007

松果體是哺乳動物的主要神經內分泌器官，可作為中樞晝夜節律振蕩器的同時合成吲哚類和多肽類激素。褪黑素（MT）是松果體的主要分泌物，對許多器官功能具有高度的整合調節作用;5-羥色胺（5-HT）是松果體細胞合成MT的中間產物，N-乙酰基轉移酶（AANAT）是一種MT限速酶，可抑制松果體細胞表達MT。微管相關蛋白-2（MAP-2）是神經元細胞骨架結構蛋白，主要存在于神經元胞體和樹突。生長抑素（SS）是一種神經調節物質。既往研究曾采用哺乳類動物、鳥、魚類的松果體器官、組織來研究松果體的形態和功能[1-4]。細胞培養技術是目前的研究熱點[5-6]。建立一種簡單、快速、有效的松果體細胞培養方法，獲得高存活率及高生物活性的松果體細胞仍是目前細胞培養的關鍵。筆者采用相關方法對新生大鼠松果體細胞進行體外分離培養，并作鑒定。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選擇 出生時間<24 h的正常清潔級SD大鼠30只，雌雄不限，體重5～6 g，所有實驗動物均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。DMEM/F12培養基、DMEM高糖培養基、胎牛血清（FBS）、鏈霉素以及青霉素均由美國Gibco公司所提供;美國Sigma公司提供多聚賴氨酸、胰蛋白酶以及阿糖胞苷;CCK-8購自上海東仁化學科技有限公司;PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 大鼠松果體細胞體外分離培養鑒定方法

1.2.1 取材 30只健康的新生SD大鼠均實行頸椎脫臼法將其處死，隨后利用75%乙醇進行徹底消毒，并將大鼠全部固定在實驗操作板上，確保整個操作過程處于無菌環境下，經其顱骨骨片向前掀開，游離粘連于顱骨上的松果體，利用顯微手術鑷剝除血管以及外膜，隨后將其放置在冷PBS加DMEM高糖培養基等體積混合液的EP管中留以備用。

1.2.2 胰酶消化分離培養 根據情況提取適量的松果體組織，隨后實行冷PBS洗滌，并加入劑量為1 mL的0.25%胰蛋白酶，隨后將其放置溫度為37 ℃的保溫箱中進行消化，消化時間控制為20 min，并輕吹1 min，將細胞吹散。隨后將液體轉至劑量為15 mL的離心管內，并用相同體積的FBS以此來終止消化，經1 000 r/min離心處理，棄上清，加入8 mL含10%的FBS、1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養基進行輕輕吹打，重懸細胞，嚴格按照按5×105/mL的細胞密度比例接種于多聚賴氨酸包被過夜的6孔培養板，讓其處于靜置狀態，并培養于體積分數5% CO2，溫度37 ℃的培養箱內進行培養。

1.2.3 松果體原代細胞分離純化及傳代培養 按照松果體細胞貼壁與神經膠質細胞時間不同的原理分別實行差速分離。提取并培養1周的分離細胞生長至90%培養板的時候，利用PBS反復清洗2次，隨后采用0.25%胰蛋白酶加以消化。隨后在顯微鏡的指引下對消化情況進行觀察，倘若細胞由緊密貼壁的形態漸漸轉改變為圓形懸浮狀態，則予等體積FBS終止消化，隨后抽取細胞懸液15 mL，實行離心以后再棄上清，將細胞懸液進行重新調配，隨后將其放置于專門的培養箱中，將培養時間控制為15 min，吸取未貼壁的細胞懸液重新接種于25 mL培養瓶，經過12 h的培養，加入阿糖胞苷2.5 μg/mL，隨后培養2 d后將溶液重新換掉。培養7 d后觀察細胞生長至培養瓶的90%左右以后，按照1︰3比例進行傳代培養，第2天再將半量更換培養基，隨后按照規定的時間進行觀察。

1.2.4 大鼠松果體細胞鑒定 間隔1 d后利用倒置顯微鏡來查看體外松果體細胞整體的變化情況。隨后抽取經過培養1周的原代松果體細胞，嚴格按照免疫熒光法進行5-HT、MAP-2鑒定。利用室溫PBS反復輕輕漂洗3次，5 min/次，再經室溫4%多聚甲醛中固定0.5 h，控制室溫讓其晾干，PBS反復清洗3次，10 min/次，0.1% Triton-100浸潤10 min，PBS反復清洗3次，10 min/次，隨后在每個孔注入劑量為200 μL的FBS，將其在室溫封閉至少1 h，隨后棄去血清，并將1︰100的兔抗鼠5-HT（Ⅰ抗）200 μL將入其中，放置于溫度為4 ℃的室內過夜，PBS反復清洗3次，10 min/次;最后將1︰500 FITC標記的羊抗兔IgG（Ⅱ抗）200 μL加入其中，放置于背光的室溫內進行1 h的孵育，PBS反復清洗3次，5 min/次;隨后進行DAPI染核（1︰2 000），放置于背光的室溫內進行2 min的孵育;最后做同型對照，不加Ⅰ抗，余步驟同前，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察松果體細胞5-HT、MAP-2。分別取培養7、14、21、28 d的松果體細胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉錄生成cRNA，采用實時定量PCR法測定大鼠松果體細胞中AANAT及SS mRNA。以GADPH為內參，根據GenBank中調取的大鼠AANAT、SS和GADPH完整cDNA序列，利用Primer 5.0引物設計軟件設計PCR引物，PCR引物序列見表1。反應體系：cDNA 2 μL，SYBR Green PCR minasterMix 20 μL，AANAT、SS和GAPDH上下游引物各1 μL，反應總體積20 μL。反應條件：95 ℃預熱、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s，72 ℃收集熒光，共45個循環。運用LightCyler 480軟件進行實時數據收集和定量分析，采用公式2-ΔΔCt法計算各樣本中AANAT及SS mRNA的相對表達量。

1.3 大鼠松果體細胞體外增殖情況觀察 根據CCK8法，將傳代第1、3、5代對數生長期細胞分別取出，隨后分別以1×105/孔的細胞密度接種在的96孔板內，每代為21個復孔。在每個孔內均注入劑量為100 μL的細胞培養液，隨后將其放置于溫度為37 ℃、5% CO2細胞培養箱中加以培養。加入10 μL CCK-8溶液后于37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養2 h。以只加入細胞培養液不加入細胞的空白孔為平行對照孔，最后比色時，以空白孔調零。用酶標儀測定不同時間點傳代第1、3、5代松果體細胞450 nm波長處的吸光度值（A450），3孔/d，連續測7 d。以培養時間（d）為橫坐標，A450值為縱坐標繪制傳代第1、3、5代松果體細胞的生長曲線。

1.4 統計學處理 使用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠松果體細胞形態 原代松果體細胞主要以懸浮狀態，而外形則以圓球形為主，當實行接種以后的15 min便會貼壁，絕大部分的細胞在經過1 d的培養后便會完成貼壁，發生貼壁后細胞主要以多角形或者是圓球形呈現，貼附于成纖維細胞層上方并且保持散在形勢不斷生長，在培養的整個流程中會伴隨著細胞的分裂而不斷地聚集生長。當培養21 d以后，其松果體細胞的體積會發生顯著增大，并且能夠在胞漿內觀察到深色的細小囊泡狀顆粒，后期生長極為旺盛，不斷分裂且活躍。經過50 d的培養，松果體細胞便不會再增殖，細胞則會呈現脫落以及死亡狀態，僅僅能夠成膠質細胞或者是纖維細胞才能存活。

2.2 不同時間點大鼠松果體細胞AANAT及SS mRNA的相對表達量比較 培養7、14、21、28 d時，隨培養時間延長，松果體細胞AANAT mRNA的相對表達量逐漸降低（P<0.05），松果體細胞SS mRNA的相對表達量先升高后降低（P<0.05）。見表2。

2.3 大鼠松果體細胞體外增殖情況 第1、3代細胞生長曲線近似“S”形，第1、3代細胞接種2～3 d后，細胞數量增多，第3、4天為對數生長期，5 d后細胞數平穩無明顯增加;第5代細胞接種后生長曲線近似平緩，A450值無明顯變化，細胞數增加不明顯，無明顯對數生長期。見表3、圖1。

3 討論

松果體細胞體外培養可以去除體液因素以及神經對松果體的作用，可作為研究其自身分泌功能、特性以及合成重要方法。然而在對細胞進行培養的整個過程中會面臨細胞不易傳代、不純以及生長緩慢等一系列問題，所以，采用成功以及簡便的方式來獲得純度高且極為穩定的松果體細胞至關重要。

本研究使用新生大鼠松果體作為細胞培養的組織來源[7]，因新生大鼠松果體常粘于顱頂骨，易于剝離，不易污染，且組織較軟，游離后易消化、離心等。培養過程中還發現使用出生24 h內新生大鼠松果體較生后10 d大鼠松果體培養效果好，考慮與新生大鼠松果體細胞較好的增殖及分化潛能有關。游離松果體后剝離外膜及血管，利于得到較純的松果體細胞，且將游離松果體置于裝有DMEM高糖的培養基中利于消化、分離后細胞的存活;松果體組織本身質地較軟，易于消化，胰酶消化時間不宜過長，吹打輕柔均可減少細胞在操作過程中的損傷;此外，本研究所采用的多聚賴氨酸對培養板進行預包被，具有一定促進松果體貼壁的重要價值作用，可顯著縮短松果體細胞貼壁的整體時間，讓細胞能夠繼續生長。當松果體細胞處于含10% FBS的DMEM/F12培養基中的時候，能夠促使其良好的增殖下去[8-9]，當培養7 d左右，可按照阿糖胞苷以及差速貼壁的方法對膠質細胞的生長起到一定的抑制作用，以此來確保純化松果體細胞同時傳代培養，同時注意阿糖胞苷濃度不易過高，否則會抑制松果體細胞的生長[10]。以上方法可以為松果體細胞體外培養創造適宜的環境，為進一步探討其生物學功能的研究提供了實驗基礎。針對松果體細胞的增殖能力進行研究，能夠對生長特征有一個深度的認識。本實驗使用CCK-8測量細胞相對的A450值繪制細胞生長曲線，能夠清晰地反映出細胞的增殖狀況，其中第1、3代細胞生長曲線近似“S”形，可見其增殖的狀況較好，針對松果體細胞體外可以進行傳代培養，而第5代細胞接種后生長曲線近似平緩，吸光度無明顯變化，細胞數增加不明顯，無明顯對數生長期。所以松果體細胞在體外培養傳代的次數有一定限制的，同時傳代3代內的細胞更適合實驗。

在體外培養條件下可以分化為多種類型的細胞，包括幾種類型的光感受細胞，如5-HT能神經元，HPC-1陽性的神經元等，根據體外培養后多種分化潛能可用多種方法進行鑒定[8]，S-antigen是位于松果體細胞內的光感受特殊蛋白，對松果體細胞也有較好的鑒別效果，GABA、神經特殊抗原（HPC-1）以及MAP-2等一系列抗體聯同突觸膜蛋白經過免疫組化已定位在培養的大鼠松果體細胞[8-10]，均能夠證明神經化學的特征。本實驗通過利用免疫熒光染色對5-HT進行鑒定，由于5-HT屬于褪黑素構成的一種中間產物，既可鑒定，同時還能對松果體細胞的功能進行初步判斷;利用MAP-2做免疫熒光鑒定，表明體外培養的松果體細胞不僅僅擁有內分泌功能，并且存在神經元特性[11-12]。

AANAT為褪黑素合成的限速酶，在體內由松果體內的交感神經終末釋放去甲腎上腺素及腎上腺素，使松果體細胞內的AANAT活性增加，最終導致MT生成增加[13]。AANAT作為神經內分泌傳感器分子在合成及調節褪黑素方面非常特殊及重要[14]。體外培養的松果體細胞的AANAT表達水平可以間接反映細胞MT的分泌水平。本研究體外培養的松果體細胞在培養第1周AANAT mRNA表達水平較高，隨培養時間的延長，AANAT mRNA表達水平逐漸減低（P<0.05），考慮原因為松果體細胞脫離機體，缺少了交感神經終末釋放的去甲腎上腺素的調節作用，AANAT的表達水平逐漸降低[15-16]。松果體除分泌MT等胺類激素外，還分泌多種肽類物質，如SS等。SS是一種神經調節多肽，在神經內分泌平衡中起復雜的調節作用，并與學習記憶活動有關[17]，主要分布在中樞神經系統和消化系統中，其他如內分泌系統的松果體等也有分布[18]。文獻[19]采用RT-PCR技術檢測到大鼠松果體培養細胞表達SS mRNA，并推測這種多肽以旁分泌的作用形式調節松果體細胞的特征形成。本研究發現體外培養的大鼠松果體細胞可表達SS mRNA，且于培養第3周表達量最高，與松果體細胞自身增殖的水平高低一致，考慮SS的確以旁分泌的方式來調節自身細胞的生長。

綜上所述，本研究以多聚賴氨酸對培養皿預包被，胰酶消化、差速貼壁分離、阿糖胞苷抑制膠原細胞生長等方法可獲得純度較高的大鼠松果體細胞，通過生長曲線的測定證明了其可體外傳代培養，但傳代次數有限，5-HT及MAP-2可較好的鑒別松果體細胞，且體外培養的細胞具有一定的生物學功能，可以作為有用的體外模型來進一步研究生物節律及內分泌系統。

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（收稿日期：2019-09-24） （本文編輯：董悅）