助孕丸質量標準提高研究

許桂麗 段靖 劉梅 魯毅 楊波 周燕萍 王亞威

助孕丸為我院自制制劑，由熟地黃、赤芍、白芍、當歸等十九味中藥材組成，其功能主治為養血活血，益腎健脾；用于黃體功能缺陷，子宮發育不良等癥的治療。在現質量標準中，僅對赤芍、熟地黃兩味藥材進行定性鑒別，難以全面控制制劑質量。本次試驗修訂了現標準中的TLC方法，并新建了白芍、當歸、川芎的薄層鑒別方法；赤芍、白芍均為方中主要藥材，芍藥苷為其共有活性成分，本試驗采用高相液相色譜法測量制劑助孕丸中芍藥苷的含量，為整體控制該產品質量提供標準和技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

安捷倫1260高效液相色譜儀（Agilent ）、KH-100超聲清洗器（昆山禾創）、FA-2004N電子分析天平（上海精科）、DZF-6050真空干燥箱（上海精宏）、CPA225D電子分析天平（Sartorius）。

1.2 試藥

熟地黃對照藥材（生產批號：121196-201406）；赤芍對照藥材（生產批號：121093-201303）；白芍對照藥材（生產批號：120905-201610）川芎對照藥材（生產批號：120918-201612）；當歸對照藥材（生產批號：120927-201617）；芍藥苷對照品（生產批號：110736-201842），購自中國食品藥品檢定研究院；助孕丸（200 g/袋，中國人民解放軍第454醫院）；乙腈是色譜純，其他為分析純。

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 熟地黃的薄層色譜鑒別 稱取助孕丸5 g，研至細粉，加水50 ml，微熱使充分溶散，煮沸，放冷后使用濾紙過濾，乙酸乙酯提取2次，每次用量為30 ml，合并兩次提取液，蒸干溶劑后加甲醇1 ml將殘渣溶解，制備出供試品溶液。取2 g熟地黃對照藥材，加水50 ml，煎煮30分鐘后冷卻，同法完成對照藥材溶液制備。取除去熟地黃藥材的其他藥材制成的陰性制劑，同法獲得陰性對照溶液。照TLC法《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，量取以上溶液各10 μl，在同一硅膠G薄層板上分別點樣，選用乙酸乙酯-二甲苯（1：1）作為展開劑，待展開后取出薄層板，自然晾干，用二硝基苯肼乙醇試液噴灑顯色。觀察結果，供試品色譜中，與熟地黃對照藥材色譜相應的位置上，有相同的淡黃色斑點出現[1-3]，陰性對照色譜無此斑點。見圖1。

2.1.2 赤芍、白芍的TLC鑒別 取助孕丸5 g，研碎，加乙醇30 ml，振搖10分鐘，過濾，蒸至溶劑剩余約1 ml，制備出供試品溶液。取白芍、赤芍對照藥材各0.6 g，混合，加乙醇20 ml，同法完成對照藥材溶液制備。取除去赤芍、白芍藥材的其他藥材制成的陰性制劑，同法完成陰性對照溶液制備。照TLC法試驗，分別量取所制溶液各10 μl，點于同一塊硅膠G薄層板上，選用三氯甲烷－甲醇－乙酸乙酯－甲酸（40：10：5：0.2）為展開劑，待展開后取出薄層板，自然晾干，用香草醛硫酸溶液（5%）噴灑顯色，放于烘箱加熱至105℃，待顯示出清晰斑點。結果顯示，供試品色譜中，和混合對照藥材TLC色譜相應的位置上，有相同的藍紫色斑點出現[4-7]，陰性對照色譜無此斑點，見圖2。

2.1.3 川芎、當歸的TLC鑒別 取助孕丸粉末10 g，加乙醚60 ml，振搖10分鐘后濾紙過濾，蒸干，取1 ml乙醇將殘渣溶解，制備出供試品溶液。取川芎、當歸對照藥材各1 g，加乙醚20 ml，同法完成混合對照藥材溶液制備。取除去赤芍、白芍藥材的其他藥材制成的陰性制劑，同法完成陰性對照溶液制備。照薄層色譜法試驗，量取所制溶液各10 μl，同一硅膠G薄層板上分別點樣，選擇正己烷-乙酸乙酯（4：1）為展開劑，待展開后取出薄層板，自然晾干，放于紫外光燈（365 nm）下查看結果。供試品色譜中，與混合對照藥材色譜相應位置上，有相同顏色熒光斑點出現[8-11]，陰性對照色譜無對應的斑點。見圖3。

2.2 芍藥苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為：InertSustain C18（5 μm，4.6×250 mm），乙腈-0.1%磷酸溶液（13：87）為流動相，流速為1.0 ml/min。檢驗波長為230 nm[12-14]。理論塔板數按芍藥苷峰計算應不低于2 000。

2.2.2 溶液的制備 對照品溶液制備 精密量取芍藥苷對照品適量，甲醇溶解，制成每1 ml含芍藥苷0.53 mg的溶液，即得。

供試品溶液制備 精密稱取助孕丸7.0 g，放于具塞錐形瓶中，精確加入50 ml甲醇，密塞并稱定重量，浸泡3.5 h后超聲處理60分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減少的重量，搖勻后用濾紙過濾，取續濾液，即得。

陰性對照溶液制備 取2.1.3中陰性制劑適量，同法完成陰性對照溶液制備。

2.2.3 專屬性試驗 按2.2.1色譜條件取助孕丸供試品、芍藥苷對照品、陰性對照溶液各10 μl進樣，陰性對照色譜中，在芍藥苷相應的出峰時間處無干擾峰出現。見圖4。

圖1 熟地黃的TLC圖譜

圖2 赤芍、白芍的薄層色譜鑒別圖

圖3 川芎、當歸的薄層色譜鑒別圖

表1 助孕丸加樣回收率試驗結果（n=6）

表2 助孕丸中芍藥苷含量

圖4 助孕丸HPLC

2.2.4 線性關系考察 分別量取“2.2.2”項下芍藥苷對照品溶液2 ml、4 ml、6 ml、8 ml、10 ml，放于10 ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，制備出對照品溶液。取上述對照品溶液各10 μl，精密稱定，按2.2.1色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以進樣量（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=1 050.9X+154.0，r=0.999 9；結果表明芍藥苷在1.06～5.30 μg范圍內與峰面積有良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取芍藥苷對照品溶液10 μl，連續進樣6次，對照品溶液峰面積的RSD為0.60%，表明精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取同一助孕丸供試品溶液，分別在0、8、16、24、48 h各進樣10 μl，測定峰面積，考察溶液穩定性，RSD為1.20%，表明供試品溶液至少在48小時內穩定。

2.2.7 重復性試驗 取同一供試品，按“2.2.2”項方法平行制備6份供試品溶液，依次測定，得出助孕丸中芍藥苷含量，RSD為1.00%，結果表明重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的助孕丸供試品（2.21 mg/g）2.00 g，6份，分別精密加入芍藥苷4.40 mg，依法檢測，算出回收率，結果見表1。

2.2.9 供試品含量測定 按“2.2.2”項方法制得助孕丸供試品溶液10批，按上述色譜條件測定，計算其所含芍藥苷量，結果見表2。由表2可知，助孕丸中芍藥苷含量最低2.14 mg/g，以最低測定值的80%為限，故擬助孕丸中含芍藥苷不得低于1.71 mg/g。

3 討論

3.1 定性物質的選擇

助孕丸處方包含十九味中藥材，成分繁雜，薄層鑒別干擾因素眾多，參考同類試驗相關資料及摸索試驗步驟，篩選出薄層色譜效果較好的熟地黃、赤芍、白芍、當歸和川芎，故選擇該5種藥材作為薄層色譜鑒別成分。由于當歸和川芎中都存在活性成分-蒿苯內酯，如果分開點樣陰性對照會相互干擾，現將當歸、川芎兩種藥材合并鑒別，當歸、川芎使用雙陰性對照進行薄層鑒別的方法在藥典中早有收載[15]。

3.2 定量物質的選擇

赤芍和白芍均為方中主要藥味，兩者都含有芍藥苷，芍藥苷具有擴張血管；鎮痛鎮靜；抗炎抗潰瘍等作用。參考相關文獻和中華人民共和國藥典（2015年版），均采用芍藥苷作為赤芍和白芍的定量物質，判斷其藥材優劣的重要指標。本實驗選擇芍藥苷作為助孕丸的定量物質，以期對制劑質量作出全面的評價。

3.3 供試品提取方法的選擇

甲醇作為提取助孕丸中芍藥苷的溶劑，比較超聲處理30 min、60 min和90 min時提取效果。其他條件相同，超聲時間為60 min、90 min時，助孕丸中芍藥苷成分能充分提取。故本試驗選擇甲醇作為提取溶劑、超聲處理60 min作為供試品的提取方法。

3.4 流動相的選擇

查閱參考文獻[12-14]，流動相中乙腈含量高時，芍藥苷分離效果不明顯；適當降低乙腈比例，選用乙腈-0.1%磷酸（13：87）、流速1 ml/min作為流動相時，芍藥苷與其他組分可完全分離，達到較佳的結果。

TLC法可鑒別助孕丸中的熟地黃、赤芍、白芍、當歸和川芎等五種藥材，操作方法簡便可行，可成為助孕丸的定性鑒別方法；HPLC法測定助孕丸中芍藥苷的含量，操作簡單易行，結果穩定準確，可作為助孕丸的含量測定方法。