三七總皂苷對轉化生長因子—誘導人胚肺成纖維細胞增殖分化及膠原蛋白合成的影響

耿德海 ，郭文龍 ，王 強 ，劉志勇 ，薛 娟 ，孫曉芳 ，谷 雨 ，劉未華 ，段 斐

（1．河北省保定市第二醫院，河北 保定 071051； 2．河北省保定市淶水縣醫院，河北 保定 074100；3．河北省保定市法醫醫院，河北 保定 071000； 4．河北大學醫學院，河北 保定 071000）

肺纖維化是多種慢性肺疾病的共同結局，其發病機制至今不明。有研究發現，肺纖維化后期主要表現為正常肺組織逐漸被增殖分化的成纖維細胞和過度聚集的膠原蛋白等細胞外基質替代[1]。因此，肺成纖維細胞的增殖在肺纖維化的發生過程中起重要作用，而由其分泌的Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白是細胞外基質的主要結構蛋白，其含量的變化和比例的改變是肺纖維化的主要病理學基礎。三七總皂苷是三七主要有效藥用成分，具有活血祛瘀、通脈活絡等功效，并能抗腫瘤、抗纖維化、抑制血小板聚集和增加腦血流量等[2]。本課題組前期研究發現，三七總皂苷對肺上皮細胞的凋亡，肺纖維化狀態的氧化應激反應，以及肺組織中基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達均有抑制作用，說明三七總皂苷有預防肺纖維化的作用[3-6]。本研究中通過體外培養人胚肺成纖維細胞MRC-5，研究三七總皂苷對MRC-5的增殖分化及膠原蛋白表達的影響，以探討三七總皂苷阻斷肺纖維化進程的體外細胞分子機制。

1 材料與方法

1．1 儀器與試藥

儀器：日產超凈工作臺（日本 Airtech公司）；HF90型CO2培養箱（香港力康生物醫療科技有限公司）；CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；ZHWY-10X型恒溫水浴箱（上海申安醫療器械廠）；BIORAD680型酶標儀（伯樂生命醫學產品有限公司）。

試藥：人胚肺成纖維細胞系（北京協和細胞資源中心，細胞株編號為MRC-5）；DMEM／EBSS細胞培養基（美國Gibco公司）；NEAA培養基（北京協和細胞資源中心）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；三七總皂苷注射液（昆明制藥集團股份有限公司，批號為20150313，規格為每支 5 mL ∶250 mg）；二甲基亞砜、四氮唑(MTT)均由美國Sigma公司提供；胰蛋白酶（美國Amresco公司）；即用型免疫組化試劑盒、辣根過氧化物酶顯色(DBA)液均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1．2 方法

細胞分組及給藥：將體外培養的人胚肺成纖維細胞MRC-5分為4組：正常對照組，不做處理；模型組，加入轉化生長因子-β（TGF-β，質量濃度為1ng／mL）；陽性藥物對照組（地塞米松組），加入TGF-β（質量濃度為1 ng／mL）＋地塞米松（質量濃度為 0．05 g／L）；三七總皂苷組，加入TGF-β（質量濃度為 1 ng／mL）＋三七總皂苷（質量濃度為1 g／L）。將細胞接種于96孔板，每組各5個復孔。加藥后充分混勻，孵育24 h。

MTT比色法檢測細胞增殖情況：MRC-5培養24 h后，各組加入相應藥物干預，分別孵育24 h和72 h后，采用MTT比色法檢測。于試驗前4 h取出96孔板，避光條件下加入質量濃度為5g／L的MTT20 μL，放入培養箱，孵育4 h，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜150 mL，振蕩混勻10 min后放入酶標儀，讀取490 nm波長下各孔光密度（OD）值，計算各組細胞生長抑制率。

免疫細胞化學法檢測細胞各指標表達情況：將細胞濃度調整到約為 1×105個／mL，37℃ 培養 24 h。各組加入相應藥物，正常對照組加入等量培養基，共孵育72 h。取出后棄去培養基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3遍，每孔加入冷丙酮2 mL，放入4℃固定10 min，棄去丙酮，取出細胞爬片，染色，脫水，封片，采用免疫細胞化學檢測(SP)法檢測各組α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和膠原蛋白表達情況，按試劑盒說明書進行操作，顯微鏡下觀察細胞染色情況；采用Image pro-plus圖像分析系統，每張爬片選取5個不同視野檢測，計算各組累積光密度值（IOD），以此為蛋白表達水平。

1．3 統計學處理

2 結果

2．1 對細胞增殖的影響

與正常對照組比較，模型組MRC-5 24 h和72 h后增殖明顯；地塞米松組和三七總皂苷組成纖維增殖顯著受到抑制，且抑制程度隨干預時間的延長而增強，但組間無顯著差異。詳見表1。

表1 三七總皂苷對MRC-5增殖比的影響（s，n＝5）

表1 三七總皂苷對MRC-5增殖比的影響（s，n＝5）

注：與正常對照組比較，＃P＜ 0．05；與模型組比較，P ＜0．05。表 2 同。

組別正常對照組模型組地塞米松組三七總皂苷組24 h 0．282 ± 0．025 0．366 ± 0．036＃0．314 ± 0．005 0．305 ± 0．101 72 h 0．367 ± 0．176 0．436 ± 0．028＃0．358 ± 0．012 0．356 ± 0．009

2．2 對細胞 -SMA蛋白表達水平的影響

模型組有大量棕褐色著色細胞表達；與模型組相比，地塞米松組和三七總皂苷組棕褐色細胞顯著減少；與正常對照組比較，模型組α-SMA蛋白表達水平升高（P＜0．05）；與模型組比較，地塞米松組和三七總皂苷組 α-SMA蛋白表達水平顯著降低（P＜0．05）。詳見圖1和表2。

圖1 三七總皂苷對MRC-5細胞 -SMA蛋白表達的影響（SP，× 200）

表2 三七總皂苷對肺成纖維細胞相關蛋白表達水平的影響（n＝5）

2．3 對Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白的影響

與正常對照組比較，模型組黃褐色細胞數量明顯增多，顯示細胞蛋白表達量較正常對照組顯著增加；與模型組比較，地塞米松組和三七總皂苷組黃褐色細胞數量明顯減少，顯示其Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達量較模型組顯著降低，地塞米松組和三七總皂苷組比較無顯著差異。詳見圖2、圖3及表2。

圖2 三七總皂苷對MRC-5細胞Ⅰ型膠原蛋白表達量的影響（SP，× 100）

圖3 三七總皂苷對各組MRC-5細胞Ⅲ型膠原蛋白表達量的影響（SP，×100）

3 討論

肺纖維化是以彌漫性肺間質改變為主要特征的肺疾病，其主要病理變化為成纖維細胞增殖分化和細胞外基質產生增多。肺成纖維細胞是產生細胞外基質的最主要細胞，其過度增殖分化是導致肺膠原蛋白合成增多和異常沉積的主要原因[7]。因此，通過抑制肺成纖維細胞增殖分化和細胞外基質的合成對于防治特發性肺間質纖維化有重要意義。本研究結果顯示，三七總皂苷可抑制肺成纖維細胞的增殖分化，并減少其膠原蛋白的合成。

研究發現，肺成纖維細胞增殖分化為表達α-SMA的肌成纖維細胞是合成細胞外基質的主要細胞[8]。肌成纖維細胞由成纖維細胞分化而來，特征性表達α-SMA，具有更強的促肺纖維化作用。這種增殖分化受多種調控因子的影響，其中，TGF-β是最重要的促進因子，也是促肺纖維化的重要因子，可促進肺成纖維細胞的增殖，并促進其分化為肌成纖維細胞[9]。肌成纖維細胞可產生大量細胞外基質，如α-SMA，Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白等，導致細胞重塑，進而促進TGF-β誘導肺成纖維細胞活化為肌成纖維細胞，從而放大纖維化的級聯反應[10]。因此，抑制肺成纖維細胞的增殖分化對于肺纖維化的防治具有重要意義。

膠原蛋白是肺纖維化細胞外基質的主要成分，膠原蛋白的分解減少和合成增加是導致肺纖維化膠原蛋白異常沉積的重要原因[11]。而這種異常又以Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白代謝異常為主。在肺纖維化的早期、晚期分別主要以Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白增加為主[12]。因此，通過藥物抑制此兩種膠原蛋白的表達將有助于肺纖維化的治療。

多項以肺纖維化模型大鼠為對象的研究發現，三七總皂苷具有抑制TGF-β合成與分泌的作用，對肺纖維化模型大鼠有顯著抗纖維化作用[13]。此外，三七總皂苷對肝纖維化、腎纖維化及腹膜纖維化等均有抑制作用[14-16]。本研究結果顯示，TGF-β可顯著促進肺成纖維細胞的增殖，并使其α-SMA受體表達增強，表明TGF-β可促進肺纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，促進肺纖維化的發展。經過三七總皂苷干預后，細胞增殖受到抑制，同時α-SMA蛋白表達水平亦有下降趨勢，表明三七總皂苷可顯著抑制肺成纖維細胞的增殖和分化，可能是其治療肺纖維化的機制之一。

通過對肺成纖維細胞Ⅰ型、Ⅲ 型膠原蛋白纖維表達的研究發現，TGF-β可顯著增加膠原蛋白的表達量，三七總皂苷對肺纖維細胞的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達量有顯著抑制作用，可降低細胞外基質沉積，從而防止肺纖維化產生。

綜上所述，三七總皂苷能抑制肺成纖維細胞的增殖及向肌成纖維細胞的轉化，抑制Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白合成，這些作用可能是其防治肺間質纖維化的機制。