石斛合劑對db／db小鼠糖尿病腎病水代謝的調(diào)節(jié)

鄭燕芳 ，張捷平 ，余文珍 ，王曉寧 ，陳 勇 ，林曉暉 ，牛朋納 ，李長征 ，林 凡 ，林自生 ，施 紅 （.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 50；.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，福建 福州 50；.福清市婦幼保健院，福建 福清 5000）

糖尿病腎病是由糖尿病微血管病變引起的嚴重并發(fā)癥之一，是目前糖尿病致死致殘的主要原因。本課題組的前期研究表明，降糖中藥復方石斛合劑可以改善糖尿病病人和高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素誘發(fā)糖尿病大鼠的糖脂代謝紊亂［1］。水代謝紊亂是糖尿病腎病的重要病理特點，為了探討石斛合劑防治糖尿病腎病的部份機制，我們選用自發(fā)性糖尿病腎病動物模型db／db小鼠作為研究對象，從調(diào)節(jié)水代謝角度初步探討石斛合劑防治糖尿病腎病的可能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗中采用的 db／db（C57BL／KsJ）小鼠是瘦素受體點突變導致瘦素信號通路障礙，從而導致小鼠出現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗、高血糖、脂肪肝等癥狀。db／db小鼠出生后6周即可出現(xiàn)明顯的肥胖和空腹血糖增加，飲水量、尿量增加，8～12周時最明顯，并可出現(xiàn)糖尿病腎病等并發(fā)癥。db／db小鼠通常以db／m小鼠作為實驗的對照組。選取db／db 小鼠 32 只，SPF 級，體質(zhì)量平均為（42.6±3.1）g；db／m 小鼠 8 只，體質(zhì)量平均為（24.2±1.4）g。 所有小鼠均為雄性，11～12周齡，由北京大學（醫(yī)學部）實驗動物科學部提供，許可證號為SCXK（京）2011-0012，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級環(huán)境。實驗期間，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲食進水，環(huán)境條件為溫度22～25℃，空氣流通，相對濕度60%～70%，12 h光照維持，晝夜循環(huán)。

1.2 藥物、試劑及儀器 石斛合劑（石斛、黃芪、丹參、葛根、五味子、生地黃、川牛膝、知母、地龍、白花蛇舌草等），六味地黃丸（熟地黃、山茱萸、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉）購自福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂，本實驗室采用水提醇沉法制備，濃縮成1.2 g生藥／mL的藥液。

BCA蛋白測定試劑盒購自杭州碧云天生物技術(shù)有限公司，AQP2、AQP3兔抗鼠一抗和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。電泳儀、BIO-RAD凝膠成像儀購自美國伯樂公司。

1.3 實驗方法 db／db小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按空腹血糖（FBG）及體質(zhì)量分成4組，分別為模型組、石斛合劑低劑量組和高劑量組、六味地黃丸組、每組8只。另取同周齡表現(xiàn)正常的db／m小鼠8只為正常組。以上各組動物分別灌胃給藥，正常組和模型組小鼠給予生理鹽水 20 mL／（kg／d），六味地黃丸組給予六味地黃丸 20 g／（kg·d），石斛合劑低劑量組和高劑量組分別給予石斛合劑6 g／（kg／d）、12 g／（kg／d）灌胃，每天 1 次，連續(xù)給藥 8 周。

1.3.1 血清學指標測定 干預第0周、4周、8周，采用割尾法取血，以魚躍（悅好I型）血糖儀快測各組空腹血糖（FBG）；干預8周后，摘眼球采血，分離血清，采用酶法測定血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。

1.3.2 腎組織病理變化 干預8周后，處死小鼠，取左側(cè)腎臟標本，按常規(guī)方法固定、脫水、包埋，切片厚5 μm，HE染色后于顯微鏡下觀察腎組織的病理變化。

1.3.3 免疫熒光法檢測腎組織中的AQP2、AQP3的蛋白表達 1.2.3中制備的腎臟標本切片后，采用免疫熒光法檢測腎組織中的AQP2、AQP3的蛋白表達情況。

1.3.4 Western Blot檢測腎組織中的 AQP2、AQP3的蛋白表達 各組小鼠的右側(cè)腎臟標本進行總蛋白提取，采用BCA法測定蛋白濃度，變性電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，分別加一抗（AQP2，AQP3兔抗鼠抗體1∶200）、二抗（辣根過氧化物酶標記山羊抗兔1∶2000），用 ECL 發(fā)光、顯影，最后用 BIO－RAD 凝膠成像儀測定條帶的光密度。

1.3.5 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料屬于正態(tài)分布的用單因素方差分析，非正態(tài)分布的用秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 干預前后各組F BG變化比較 見表1。

表1 干預前后各組FBG變化比較（）mmol／L

表1 干預前后各組FBG變化比較（）mmol／L

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

組別正常組模型組石斛合劑低劑量組石斛合劑高劑量組六味地黃丸組n 8 8 7 8 6干預第0周5.30±0.55 16.70±3.561）18.70±2.971）14.93±3.871）18.03±4.611）干預第4周4.86±0.60 18.29±4.24 16.47±2.14 13.24±1.773）16.47±3.29干預第8周4.931±0.44 18.74±3.61 15.13±1.982）11.28±1.843）14.22±2.792）

2.2 干預8周后各組Scr和BUN比較 見表2。

表2 干預8周后各組Scr和BUN比較（）

表2 干預8周后各組Scr和BUN比較（）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組模型組石斛合劑低劑量組石斛合劑高劑量組六味地黃丸組n 8 8 7 8 6 Scr／（μmol／L-1）83.53±10.46 216.80±31.661）135.40±10.382）104.10±7.182）118.40±11.162）BUN／（mmol／L）5.34±0.64 13.51±3.661）8.72±1.192）6.63±0.582）6.58±0.942）

2.3 各組腎臟病理變化 由圖1可見：HE染色后，光鏡下可見正常組腎組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小球大小、形態(tài)及腎小球囊腔間隙均正常，系膜基質(zhì)正常；模型組腎小球系膜基質(zhì)增多，系膜區(qū)增寬，部分毛細血管腔狹窄，大量紅細胞淤積，腎小管細胞體積增大，管腔狹窄；石斛合劑組較模型組有明顯改善。

2.4 各組腎臟AQP2、AQP3表達變化 由圖2和圖3可知：模型組腎臟AQP2、AQP3的蛋白表達較正常組顯著升高，石斛合劑高劑量組腎臟AQP2、AQP3蛋白表達較模型組有明顯降低。說明糖尿病腎病小鼠體內(nèi)存在水代謝紊亂，腎臟AQP2、AQP3表達異常增多，石斛合劑可能通過調(diào)節(jié)AQP2、AQP3的表達，調(diào)節(jié)體內(nèi)水代謝平衡，從而起到防治早期糖尿病腎病的作用。

圖1 各組腎臟病理變化（×400）

3 討 論

3.1 糖尿病腎病是糖尿病發(fā)展到后期階段腎臟功能衰竭導致的一系列病理癥狀，早期糖尿病腎病的中醫(yī)辨證以氣陰兩虛為主，并可挾水濕、濕熱、氣滯、瘀血等［2］。施紅教授經(jīng)過長期臨床實踐，根據(jù)糖尿病的病機特點，創(chuàng)立了滋陰清熱、益氣活血通絡、補益脾腎的石斛合劑方［3］。前期研究表明：石斛合劑能減少2型糖尿病模型動物胰島細胞凋亡，促進胰島素分泌，降低血糖血脂，改善腎功能，減輕2型糖尿病患者胰島素抵抗作用［4-5］。

3.2 db／db小鼠是美國 Jackson實驗室從C57BL／6J小鼠中篩選的瘦素受體基因缺陷的突變系，具有自發(fā)形成2型糖尿病的特性，其發(fā)病過程與人類2型糖尿病非常相似。該小鼠出生約1個月后逐漸出現(xiàn)肥胖、高血糖、高血脂、糖尿等糖尿病癥狀，至出生后約2個月，開始出現(xiàn)糖尿病腎病癥狀，是研究2型糖尿病腎病理想的動物模型［6］。

3.3 石斛合劑對db／db小鼠腎功能的影響 Scr與BUN反映腎小球的濾過功能，當腎小球功能受損達50%以上時，血清肌酐與尿素氮出現(xiàn)升高。本次實驗觀察發(fā)現(xiàn)：19～20周 db／db小鼠血清尿素氮與肌酐明顯升高，表明腎功能明顯損傷；石斛合劑的干預，能夠有效降低db／db小鼠血清尿素氮與肌酐，具有防治糖尿病腎病的功效。

圖2 各組腎臟AQP2、AQP3表達（×100）

圖3 各組腎臟AQP2、AQP3表達

3.4 石斛合劑對db／db小鼠腎臟水通道蛋白的影響 AQP2主要作用是維持機體水平衡，參與尿液濃縮和滲透壓調(diào)節(jié)［7］。糖尿病患者多尿和水腫現(xiàn)象與水通道蛋白的作用密切相關，已有實驗證明在糖尿病動物模型中AQP2的表達顯著上調(diào)［8］，與本實驗顯示結(jié)果一致。AQP3除調(diào)節(jié)腎臟集合管主細胞水分重吸收及尿液濃縮外，還介導機體甘油、尿素等小分子物質(zhì)的代謝，對終尿量形成起重要作用。當其表達產(chǎn)生異常時會導致尿液濃縮障礙，產(chǎn)生多飲、多尿現(xiàn)象。但糖尿病對AQP3表達的影響目前尚存在爭論，有研究發(fā)現(xiàn)在STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟內(nèi)髓中，AQP3的表達明顯上調(diào)，而在STZ誘導的糖尿病小鼠的研究中發(fā)現(xiàn) AQP3的表達下調(diào)［9-10］，而本實驗中AQP3的蛋白表達也是上調(diào)的。

本實驗結(jié)果可知：db／db小鼠呈現(xiàn)高血糖、腎功能障礙，說明早期糖尿病腎病小鼠模型已經(jīng)建立；模型組AQP2、AQP3的蛋白表達增多，石斛合劑可下調(diào)AQP2、AQP3的異常高表達，最終達到改善小鼠血糖和腎功能的作用，表明石斛合劑防治早期糖尿病腎病的作用可能與調(diào)節(jié)水代謝相關。

由于糖尿病腎病的發(fā)生除了與水代謝相關外，還和高胰島素血癥、高脂血癥、脂毒性、氧化應激、腎血流動力學改變等多因素密切相關，故中藥石斛合劑改善腎功能所涉及的分子藥理機制還有待進一步深入研究。