片仔癀治療潰瘍性結腸炎的實驗研究

邱 赟 ，韓升霞 ，劉麗雅 ，沈阿靈 ，林于雄

（1.寧德市中醫(yī)院，福建 寧德 352100；2.福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 350122）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）屬常見腸道疾病，主要包括潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）、克羅恩病（crohn's disease，CD），其中以UC較為多見。 UC是一種反復發(fā)作、病因尚不明確的慢性非特異性腸道疾病，臨床主要表現為腹痛、腹瀉以及粘液血便。近年來，炎癥性腸病的發(fā)病率成上升趨勢，已成為我國常見的消化道疾病之一［1-2］。新近研究發(fā)現：鈣衛(wèi)蛋白（calprotectin，CP）和干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素-6（IL-6）等炎性因子相似，是中性粒細胞來源的炎性反應蛋白，也因此被當作一種新型的炎癥標記物，已成為國內外學者關注的熱點，在檢測炎癥性腸病的進程中具有重要作用［3-4］。

閩產特色中成藥片仔癀（pien tze huang，PZH）至今已有450多年的歷史，是由漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司獨家生產的國家一級中藥保護品種，在國內外享有較高知名度的中成藥品種之一。在長期的臨床應用中，片仔癀對包括急慢性肝炎在內的許多炎癥相關性疾病都具有明確的治療作用［5］。為了進一步探討片仔癀對UC的治療作用及其機制，本研究通過建立葡萄糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導的UC小鼠模型，觀察片仔癀對UC小鼠鈣衛(wèi)蛋白和細胞炎癥因子的影響，以期為片仔癀的二次開發(fā)提供進一步的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 片仔癀（漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，生產批號：2016020001），規(guī)格 3 g／粒，配制前用刮刀刮取適量片仔癀，用雙蒸水溶解配制成0.1 g／mL，于 4 ℃保存待用；葡萄糖硫酸鈉（DSS，美國 MP Biomedicals公司）；CP、IFN-γ 和 IL-6 ELISA檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；Bradford蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術研究所）。

1.2 實驗動物 雄性SPF級BALB／c小鼠24只，體重為18～20 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗研究。

1.3 儀器 ELX800酶標儀（美國Bio-Tek公司）；AB204-N電子天平（瑞士Mettler toledo公司）；5417R高速冷凍離心機（德國 Eppendorf公司）。

1.4 分組及給藥 采用飲用含有3%DSS飲用水的方法誘導建立UC小鼠模型。將24只BABL／c小鼠按隨機數字表法分為正常組、模型組和治療組各8只。正常組給與正常飲用水，模型組和治療組連續(xù)自由飲用含 3%DSS的飲用水 7 d［6-7］，從第 8天開始模型組和治療組恢復給予正常飲用水，至第11天實驗結束。在造模前1天，治療組開始口服灌胃PZH 溶液（劑量為 234 mg／kg），每日給藥，正常組和模型組口服灌胃與PZH溶液等體積的生理鹽水。

1.5 疾病活動指數（disease activity index，DAI）

實驗結束后，參考文獻［8］，采用盲法方式觀察并記錄小鼠體重、腹瀉和便血等臨床體征，按表1進行評分［7-9］，表中3項指標得分平均值即為DAI。

表1 DAI計算方法

1.6 血樣標本和結腸組織標本的采集 在第11天實驗結束后，小鼠眼框采集血樣標本，然后用頸椎脫臼法處死小鼠后，在冰上操作，由肛門向上截取結腸標本，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，測量結腸長度并記錄；同時留取結腸樣本用于病理組織學檢測。

1.7 病理組織學檢測 取約1.0 cm結腸組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚組織切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察結腸組織病理學變化。

1.8 IFN-γ、IL-6和CP的檢測 采用酶聯免疫分析（ELISA）檢測小鼠血清中 IFN-γ、IL-6和 CP水平，詳細操作步驟參照試劑盒說明。

1.9 統計學方法 本實驗采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料屬正態(tài)分布的以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組小鼠體重、DAI和結腸長度的比較 由表2可見：經3%DSS可建立UC小鼠模型，片仔癀干預能夠顯著改善DSS誘導的UC。

2.2 各組小鼠結腸組織形態(tài)學的變化 由圖1可見：正常組小鼠結腸黏膜完整，黏膜上皮細胞排列整齊，腺體排列整齊、結構清楚，有大量的杯狀細胞，未見顯著病理形態(tài)學改變；而模型組結腸組織黏膜結構不完整，可見結腸黏膜脫落形成的潰瘍灶，大量炎癥細胞浸潤黏膜及黏膜下層，以中性粒細胞為主，并伴有少量淋巴、單核細胞，腺體正常結構喪失，排列紊亂，腺腔消失；治療組中小鼠結腸壞死灶、潰瘍面積較模型組有所減少，黏膜和腺體排列與模型組比較較整齊，炎性細胞浸潤黏膜層及黏膜下層明顯減少。可見，片仔癀能明顯緩解DSS誘導的小鼠結腸炎癥病變程度。

表2 各組小鼠體重、DAI和結腸長度的比較

圖1 各組小鼠結腸的 HE染色結果（×100）

2.3 各組小鼠血清中IFN-γ、IL-6和CP水平變化比較 由表3可見：片仔癀可能通過抑制血清中IFN-γ、IL-6和CP的水平，起到緩解DSS誘導的結腸炎作用。

表3 各組小鼠血清中IFN-γ、IL-6和CP水平變化比較

3 討 論

現代醫(yī)學認為UC的發(fā)生發(fā)展與遺傳性、免疫調節(jié)異常、感染和環(huán)境等因素有關，但對其發(fā)病機制尚不完全明了。UC由于其病程長、易復發(fā)和緩解期與活動期反復交替，因此世界衛(wèi)生組織定義其為現代難治疾病之一［10］。目前臨床常用治療藥物有糖皮質激素制劑、5-氨基水楊酸制劑、生物制劑等［11］。但激素類藥物具有降低抗感染的免疫力，可誘發(fā)上消化道出血、骨質疏松等不良反應；而5-氨基水楊酸類藥物易引起腹瀉、惡心、皮疹等毒副作用。因此，尋找更為安全且療效好的治療藥物顯得尤為重要。而長期的臨床實踐證明，傳統的中藥復方對本病治療有積極作用，其標本兼治、多途徑和毒副作用少等優(yōu)點，已經呈現出了巨大的開發(fā)價值和潛力 ［12-14］。

片仔癀處方和工藝屬于國家絕密級組方，目前公開的處方為三七、牛黃、麝香、蛇膽等4味藥材，具有顯著的清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛功效。本研究結果表明：片仔癀對DSS誘導的UC模型小鼠具有良好療效，經片仔癀治療后可抑制DSS誘導的體重下降、DAI評分增加和結腸縮短，以及減少模型小鼠結腸的潰瘍灶和炎性細胞浸潤。

IFN-γ和IL-6是Th1型細胞因子的重要組成部分，二者均是促炎癥細胞因子，在炎癥反應過程中起著重要的作用。近年來的許多研究已經證實，IFN-γ和IL-6及其信號傳導通路參與了UC的發(fā)生發(fā)展［15-17］。臨床研究表明：UC患者血清中IFN-γ和IL-6的含量會顯著增加［18-19］。CP是一種來源于中性粒細胞和巨噬細胞的含鈣蛋白，其表達具有組織或細胞特異性，是嗜中性粒細胞的主要炎性反應蛋白。中性粒細胞的脫顆粒可釋放CP，是中性粒細胞更新的重要標志物［20-21］。近年來的研究發(fā)現：CP作為一種新型急性炎癥標志物，在UC患者中明顯升高［3，22］。本研究結果顯示：IFN-γ、IL-6 和 CP 在UC模型組小鼠血清中的含量與正常組比較明顯升高，片仔癀可以有效地抑制IFN-γ、IL-6和CP含量的增加，說明抑制IFN-γ、IL-6和CP含量的增加可能是片仔癀治療UC的作用機制之一。

綜上所述，UC發(fā)生發(fā)展是多因素、多環(huán)節(jié)作用的結果，而片仔癀治療具有多成分、多途徑的作用機制特點。在本實驗研究的基礎上，我們將繼續(xù)深入開展片仔癀治療UC作用機制研究，以期闡明片仔癀治療UC的作用機理、靶點和通路，為擴大片仔癀的臨床適應癥和為其二次開發(fā)提供進一步的實驗依據。