HPLC法同時測定復方三維右旋泛酸鈣糖漿中黨參炔苷和枸櫞酸的含量

任強強 ，許 文 ，黃鳴清 ，葉水國 ，蘇志偉

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建省中藥學重點實驗室，福建 福州 350122；3.國藥控股星鯊制藥（廈門）有限公司，福建 廈門 361028）

復方三維右旋泛酸鈣糖漿，原名維他肥兒膏或維力膏，收載于化學藥品地標升國標第10冊藥品標準，其主要成分由維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酰胺、泛酸鈣5種B族維生素和10味中藥（黨參、焦白術、茯苓、炒薏苡仁、芡實、山藥、山楂、焦麥芽、蓮子、炒扁豆）復方提取物組合而成，其中復方中藥流浸膏在制劑中的含量為0.053 96 mL／g，是一種以中藥為主的健脾胃中西復方制劑，其主治功能為“補中益氣，健脾止瀉，消食導滯”，用于小兒脾胃虛弱、體倦神疲及小兒病后調理的滋補營養劑，尤其適用于小兒營養不良及維生素缺乏癥［1］。

方中黨參扶脾益胃、補中益氣，為補氣健脾之要藥，同時也是方中的君藥；山楂為健脾開胃、消食化滯的良藥，同時為方中佐藥。中國藥典2015年版以黨參炔苷為對照，對黨參藥材進行薄層鑒別評價。現代藥理研究表明聚炔類成分有明顯的抗菌、殺菌、抗炎、抗癌、免疫力抑制及酶抑制的生物活性［2］。黨參炔苷除這些藥理作用外，亦有通過影響卵巢顆粒細胞增殖分化而影響生殖系統的作用［3］，常作為黨參的指標性成分［4-5］，也是其功效的藥效物質基礎。研究表明黨參炔苷具有抗胃黏膜急性損傷的作用，與黨參補中益氣的傳統功效相符，為黨參胃黏膜保護作用的活性成分［6］，因此是復方三維右旋泛酸鈣糖漿的重要活性成分。山楂中的有機酸被認為是消食健脾的有效成分［7］，有助消化、促進胃腸運動、調節血脂和預防腫瘤的作用，是促消化功能的主要藥效部位［8-9］，并且其有機酸類物質以枸櫞酸含量最高，可達 17.50 mg／g［10］，中國藥典 2015 年版也以枸櫞酸作為山楂有機酸總量測定的指標成分。因此，黨參炔苷和枸櫞酸的含量測定可作為該制劑質量控制環節的重要指標成分。

目前，關于復方三維右旋泛酸鈣糖漿中化學成分的測定已有文獻報道［11-12］，但是均未涉及到制劑中中藥成分的含量測定，難以全面反映復方三維右旋泛酸鈣糖漿復方制劑的質量。為了更全面地控制該制劑的質量，本研究建立高效液相色譜法對復方三維右旋泛酸鈣糖漿中黨參炔苷和枸櫞酸的含量進行同時測定，為制劑的質量評價體系提供更有力的依據，確保其在臨床方面的療效。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent Technologies公司），包括 G1311C四元泵、G1329B自動進樣器、G1315B二極管陣列檢測器、G1316A柱溫箱和Agilent ChemStation工作站；CPA225D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）。10個批次復方三維右旋泛酸鈣糖漿均來源于國藥控股星鯊制藥（廈門）有限公司。對照品黨參炔苷（批號：111732-201607）和枸櫞酸（批號：100396-201603，含量為100.0%）購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純（德國MERCK公司）；磷酸（上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司）；甲酸、乙酸為色譜純（上海阿拉丁試劑有限公司）；磷酸二氫銨為分析純（廣東西隴科學股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Luna C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.01 mol·L-1NH4H2PO4（含 0.03%H3PO4）水（B）溶液，等度洗脫（0～10 min，10%A）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。 在上述色譜條件下，對照品與樣品的色譜圖見圖1。

圖1 對照品、供試品和陰性樣品的HPLC色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液制備 精密稱取黨參炔苷和枸櫞酸的對照品適量，分別置于25 mL量瓶，純甲醇稀釋至刻度，得單一對照品母液，質量濃度分別為 686、546 μg／mL。分別取黨參炔苷和枸櫞酸對照品母液適量，共同置于5 mL量瓶中，用10%甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，得到質量濃度為274.4、218.4 μg／mL的混合對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液制備 取復方三維右旋泛酸鈣糖漿5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，移液管移入超純水15 mL，振搖20 min至完全溶解，移入25 mL量瓶，錐形瓶用超純水潤洗3次，洗液并入量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液制備 分別取缺黨參和山楂的復方三維右旋泛酸鈣中藥復方處方，按照復方三維右旋泛酸鈣中藥復方中間體制備過程提取濃縮，并加入相關輔料制備成陰性糖漿樣品，取陰性樣品5 g，按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性實驗 取“2.2.3”項下陰性對照溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，發現陰性無干擾，具體見圖 1。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 取“2.2.1”項下方法制備的各對照品儲備液，用10%甲醇稀釋，配成黨參炔苷質量濃度分別為 10.976、16.464、34.3、68.6、137.2、274.4 μg／mL，枸櫞酸質量濃度分別為 8.736、13.104、27.3、54.6、109.2、218.4 μg／mL 的系列混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件進行分析，以質量濃度X為橫坐標，以峰面積均值Y為縱坐標，進行回歸處理，得到2個分析物的回歸方程。以信噪比（S／N）10∶1為基準測得各化合物的定量限，結果見表1。

表1 線性關系及定量限

2.4.2 精密度試驗 取同一濃度混合對照品溶液（黨參炔苷和枸櫞酸的質量濃度分別為68.6、54.6 μg／mL），按“2.1”項下色譜條件進行分析，1 d 內連續進樣6次，測得方法的日內精密度；連續測定3 d，每天進樣測定6次，計算日間精密度。黨參炔苷和枸櫞酸日內峰面積的RSD值分別為1.30%、1.31%，日間峰面積的RSD值分別為1.58%、1.61%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一樣品的供試品溶液（編號為 S3），分別在制備后 0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”項下色譜條件進行分析，記錄黨參炔苷和枸櫞酸的峰面積，計算得峰面積的RSD值分別為1.03%和0.50%，表明供試品溶液在制備后24 h內穩定。

2.4.4 重復性試驗 取同一批次樣品（編號為S3），按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行分析，分別測得黨參炔苷和枸櫞酸平均含量分別為0.086 87和1.066 mg／g，含量的RSD值分別為1.24%和0.80%，結果表明方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密量取重復性實驗同批復方三維右旋泛酸鈣糖漿2.5 g，每3份加入相同量（分別為已知含量的80%、100%、120%）的黨參炔苷和枸櫞酸對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試溶液，進樣測定，計算各待測成分的加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝9）

2.5 樣品測定 取10批復方三維右旋泛酸鈣糖漿，分別精密稱取約5 g樣品，每批平行3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述“2.1”項下色譜條件進樣10 μL測定峰面積，根據標準曲線計算其含量，結果見表3。

3 討 論

3.1 色譜柱的選擇 本研究測定黨參炔苷和枸櫞酸的含量，嘗試考察了4種不同型號色譜柱，分別為ZORBAX SB-C18（4.6×150 mm，5 μm）、ZORBAX Bonus-RP（4.6×250 mm，5 μm）、Thermo BETASILC18 Analytical（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm），預實驗結果表明：ZORBAX SB-C18色譜柱只檢測到待測成分枸櫞酸；ZORBAX Bonus-RP色譜柱對兩種待測成分均有檢出，但各待測成分色譜峰拖尾嚴重；采用Thermo BETASIL C18色譜柱時，兩種待測成分出峰靠前且分離度較差；而 Phenomenex Luna C18（2）色譜柱對黨參炔苷和枸櫞酸的測定均有較好的分離度且達到基線分離，可能是該色譜柱測定的pH范圍在1.5～10，pH范圍較廣且通用性好，對多數化合物均有較好的保留能力。

表3 復方三維右旋泛酸鈣中黨參炔苷和枸櫞酸含量測定結果（mg／g，n＝3）

3.2 流動相系統的優化 對于流動相的篩選，首先比較了甲醇和乙腈兩種有機相體系，結果顯示甲醇體系要優于乙腈體系；然后進一步考察甲醇體系下不同酸水對色譜分離的影響，包括0.1%甲酸、0.1%乙酸、0.01%磷酸和 0.01 mol／L NH4H2PO4（含0.01%H3PO4），結果表明單一酸水相條件下有機酸的色譜峰會出現寬峰或峰形不對稱的情況，而甲醇-0.01 mol／L NH4H2PO4（含 0.01%H3PO4）體系均能達到檢測效果，兩種待測成分分離效果最優。本實驗也考察了磷酸二氫銨酸水相不同濃度及含酸量，比較了0.01、0.02 mol／L兩種濃度磷酸二氫銨及含0.01%、0.02%、0.03%和0.05%磷酸的不同含酸量，結果顯示高濃度磷酸二氫銨會造成枸櫞酸色譜峰分離度較差情況且易損害分析儀器，低含酸量（0.01%、0.02%）時枸櫞酸色譜峰出現裂峰且分離度較差，高含酸量（0.05%）時枸櫞酸色譜峰出現寬峰，而0.03%含酸量時兩種待測成分出峰及各項指標最優，從而選擇 0.01 mol／L NH4H2PO4（含 0.03%H3PO4）組成的酸水相。

3.3 測定波長的選擇 檢測波長直接影響待測物質的信號產生及大小，比較不同波長下的色譜圖得出：黨參炔苷的吸收范圍為210～270 nm，響應值先降低后增加再降低，但增加趨勢階段的最大響應值仍小于210 nm處的響應值，最大吸收在210 nm；枸櫞酸的吸收范圍為210～250 nm，響應值逐漸降低，最大吸收在 210 nm。有文獻［13-14］報道：黨參炔苷的檢測波長往往選擇270 nm左右，枸櫞酸的檢測波長為210 nm。但在本實驗中270 nm波長下枸櫞酸響應值很低，綜合兩種檢測成分響應值的高低及陰性干擾的大小，最終采用210 nm的波長檢測，此時兩種待測成分響應值較高，基線平穩且檢識良好。

3.4 樣品測定結果 本實驗對10個批次的復方三維右旋泛酸鈣糖漿中黨參炔苷和枸櫞酸進行含量測定，黨參炔苷的含量范圍為0.084 26～0.109 60 mg／g，枸櫞酸的含量范圍為 0.930 7～1.292 0 mg／g。經統計，10個批次復方三維右旋泛酸鈣糖漿中黨參炔苷和枸櫞酸含量的平均值分別為0.097 80、1.114 5 mg／g，不同批次復方三維右旋泛酸鈣糖漿之間黨參炔苷和枸櫞酸的含量差異較小。

綜上，本文建立了HPLC法同時測定復方三維右旋泛酸鈣糖漿中黨參炔苷和枸櫞酸成分的定量分析方法，該方法簡便、準確、重復性好，適用于制劑中黨參炔苷和枸櫞酸的含量測定，為其質量控制提供實驗依據。