花生3-磷酸甘油?；D移酶基因的功能鑒定

姜竹 陳丹丹 劉宏波

摘要：花生（Arachis hypogaea）是我國的主要油料作物，花生油脂的合成受3-磷酸甘油?；D移酶（GPAT）調控，但其調控機制尚不清楚。從花生中克隆了13個GPAT基因，編碼含有4個?；D移酶保守結構域的蛋白;同時，運用酵母遺傳互補體系對基因功能進行了鑒定。在該體系中，酵母雙突變體菌株ZAFU1（Δgat1/Δgat2）因缺少GPAT而不能在特定的葡萄糖培養基上生長。結果表明，AhGPAT1/2/3/6/9與空白載體一樣，其導入并不能恢復酵母雙突變體ZAFU1在葡萄糖中的生長缺陷，而AhGPAT5B、AhGPAT7A/B的導入能恢復酵母雙突變體ZAFU1在葡萄糖中的生長缺陷，說明上述3個基因具有?；D移酶活性，從而為進一步研究花生油脂的合成代謝調控提供了參考。

關鍵詞：花生;3-磷酸甘油酰基轉移酶（GPAT）;遺傳互補;酵母雙突變體菌株

中圖分類號： S565.201 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0056-05

油脂是高等植物的主要能量儲存形式，可為植物的種子萌發、花粉發育和有性生殖等提供能量，對于植物的生長發育至關重要[1]。植物油可為人類提供能量和營養，同時也是重要的工業原料[2]。我國的花生（Arachis hypogaea）總產量、單位面積產量和出口量一直位居我國油料作物之首，在我國油脂供應、出口創稅和國民經濟發展中占有舉足輕重的地位，但是花生油脂的合成機制目前尚不清楚[3-4]。

植物油的主要成分是三酰甘油（TAG），由3-磷酸甘油酰基轉移酶（GPAT）、溶血磷脂酸?；D移酶（LPAAT）和二酰甘油?；D移酶（DGAT）依次催化脂肪酸鏈摻入甘油骨架的sn-1、sn-2、sn-3位而生成[5-6]。目前，關于甘油脂合成前2步酰化反應的酶，特別是第1步酰化反應的酶知之甚少。研究者在擬南芥、油菜、水稻和向日葵等多種植物中已成功克隆了多個編碼?；D移酶的GPAT基因[7]，但普遍認為，除了ATS1，只有GPAT9直接參與甘油脂的合成，其他GPAT是否參與甘油脂合成并不清楚[8-10]。已有研究者從花生中克隆了部分GPAT基因，并對其表達特性進行了分析，但是關于花生GPAT酶的特性尚無相關報道[11-12]。本研究從山花15中分離了13個3-磷酸甘油?；D移酶基因，并用酵母遺傳互補體系對上述基因進行了功能鑒定，發現AhGPAT1/2/3/6/9不能恢復酵母雙突變體ZAFU1在葡萄糖中的生長，AhGPAT5B、AhGPAT7A/B能恢復酵母雙突變體ZAFU1在葡萄糖中的生長，說明上述3個基因具有?；D移酶活性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花生品種山花15、酵母菌株ZAFU1[13]、大腸桿菌菌株DH5α和酵母表達載體pYES2-yADH1-Kan V2[14]均由筆者所在實驗室保存。RNA提取試劑盒，購自杭州新景生物試劑開發有限公司;質粒提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒、膠回收試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;高保真酶PrimeSTAR、PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒、DNA連接酶以及限制性內切酶，購自TaKaRa公司。引物由賽默飛世爾科技有限公司合成?；驕y序由鉑尚生物技術有限公司完成。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

參照植物總RNA提取試劑盒說明書提取花生根、葉的總RNA。測定總RNA的濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證RNA的完整性，用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。

1.3 基因克隆和重組載體的構建

參考已有的研究，檢索得到花生GPAT1/2/3/5/6/8/9基因的核苷酸序列，以這些基因結合擬南芥GPAT氨基酸序列，在花生數據庫peanutbase中進行同源檢索，得到候選AhGPAT序列，基于此確定花生GPAT1A/1B/2A/2B/3B/5B/6A/7A/7B/8A/9A-1/9A-2/9B序列的信息。結合候選基因序列和表達載體酶切位點，在SIGMA網站上設計各基因的PCR擴增引物（表1）。

以花生cDNA為模板，用帶有酶切位點的引物進行RT-PCR擴增，并對目的片段進行膠回收。將酶切后的AhGPAT與酵母表達載體pYES2-yADH1-Kan V2進行連接，轉化至大腸桿菌DH5α中，涂布在含有50 mg/L卡那霉素的LB培養基上，37 ℃過夜培養，次日進行菌落PCR檢測，并進行測序和序列比對。最后提取測序成功的AhGPAT-pYES2-yADH1-Kan V2重組質粒備用。

1.4 系統發育樹分析

使用DNAMAN對已克隆的10個AhGPAT基因（AhGPAT1A/1B/2A/2B/3B/5B/6A/7A/7B/8A）編碼的蛋白氨基酸序列進行比對，使用MEGAX軟件對AhGPAT的氨基酸序列進行系統發育樹分析，系統發育樹采用Neighbour-Joining（鄰接）方法[15-16]構建。

1.5 AhGPAT-pYES2-yADH1-Kan V2載體轉化酵母雙突變體及酵母濃度梯度稀釋試驗

通過LiAc法制備ZAFU1酵母感受態細胞，將重組質粒AhGPAT-pYES2-yADH1-Kan V2、pYES2-yADH1-Kan V2空白載體和GAT1-pYES2-yADH1-Kan V2陽性對照轉入酵母雙突變體ZAFU1感受態中。分別涂布于含有葡萄糖（glucose）、半乳糖（galactose）的SC-Ura-His-Leu固體培養基上，于30 ℃培養4～7 d。挑選SC-Ura-His-Leu+葡萄糖固體培養基中的酵母單菌落進行搖菌培養，將菌液分別稀釋至D600 nm=1、0.2，0.04、0.008、0.000 16，取5 μL分別涂布于SC-Ura-His-Leu+半乳糖、SC-Ura-His-Leu+葡萄糖固體培養基上，于30 ℃培養4～7 d。

2 結果與分析

2.1 不同AhGPAT氨基酸序列的差異分析

本研究分離了AhGPAT的8個不同成員，共13個基因。分離的由AhGPAT編碼的蛋白羧基端均有典型的?；D移酶的4個保守結構域（AhGPAT9除外）：AT-Ⅰ、AT-Ⅱ、AT-Ⅲ 和AT-Ⅳ（圖1），保守結構域中與酰基轉移酶催化活性相關的氨基酸是AT-Ⅰ 的組氨酸（His）及天冬氨酸（Asp）、AT-Ⅲ 的甘氨酸（Gly）、AT-IV的脯氨酸（Pro）;與底物甘油綁定相關的氨基酸是AT-Ⅱ的精氨酸（Arg）、AT-Ⅲ 的谷氨酸（Glu）。

為了更好地確定花生GPAT的親緣關系，對AhGPAT進行系統發育樹分析，并對部分AhGPAT進行氨基酸序列比對。

結果顯示，分離的由AhGPAT編碼的蛋白之間的氨基酸序列相似度為19.1%～99.7%。栽培花生A/B 2個亞基因組和亞基因組內由AhGPAT編碼的蛋白氨基酸相似度極高，為 96.3%～99.7%。系統發育樹結果表明，分離的由AhGPAT編碼的蛋白可聚成兩大分支：AhGPAT1/2/3/5/6/7/8和AhGPAT9（圖2）。其中，AhGPAT1/2/3/5/6/7/8蛋白可分為3個亞家族：AhGPAT1/2/3、AhGPAT5/7和AhGPAT6/8;AhGPAT2和AhGPAT3的親緣關系較近，AhGPAT3B氨基酸序列與AhGPAT2A、AhGPAT2B氨基酸序列的相似度分別為73.0%、73.2%。AhGPAT5/7的親緣關系較近，AhGPAT5B氨基酸序列與AhGPAT7A、AhGPAT7B氨基酸序列的相似度分別為80.4%、80.9%。AhGPAT6A與AhGPAT8A的親緣關系較近，二者的氨基酸序列相似度為74.9%。AhGPAT9與其他AhGPAT的親緣關系較遠。

2.2 AhGPAT的功能分析

2.2.1 重組酵母表達載體的構建 對AhGPAT-pYES2-yADH1-Kan V2重組質粒進行酶切鑒定，獲得如圖3所示與預期大小一致的目的條帶，表明AhGPAT-pYES2-yADH1-KanV2重組質粒已構建成功。

2.2.2 酵母遺傳互補及酵母濃度梯度稀釋試驗 筆者所在實驗室構建了GAT1、GAT2雙敲除的ZAFU1（gat1Δgat2Δ+[pGAL1：：At1g06520 Leu2]）菌株，其本身含有His3篩選標記， 同時含有Leu2篩選標記的YEplac181-AtGPAT1重組質粒，該質粒GAL1啟動子在半乳糖條件下能夠誘導AtGPAT1基因的表達，但在葡萄糖條件下，AtGPAT1基因不能表達。因此該酵母雙突變體ZAFU1只能在SC+Ura-His-Leu+Galactose培養基中生長，不能在SC+Ura-His-Leu+Glucose培養基中生長。pYES2-yADH1-Kan V2空白載體含有合成尿嘧啶的基因，該質粒yADH1啟動子受葡萄糖誘導，受半乳糖抑制，因此轉入該載體的酵母菌株若能在 SC-Ura-His-Leu+Glucose 培養基上生長，則證明轉入酵母雙突變體ZAFU1的目的基因具有?；D移酶活性。

本研究將轉化重組質粒AhGPAT-pYES2-yADH1-Kan V2、pYES2-yADH1-Kan V2空白載體和GAT1-pYES2-yADH1-Kan V2的酵母雙突變體分別培養在SC-Ura-His-Leu+Galactose、SC-Ura-His-Leu+Glucose培養基上，發現轉pYES2-yADH1-Kan V2空白載體和AhGPAT1A/1B/2A/2B/3B/6A/9A-1/9A-2/9B的酵母雙突變體均不能在SC-Ura-His-Leu+Glucose培養基上生長，而轉GAT1陽性對照、AhGPAT5B、AhGPAT7A/B的酵母雙突變體能在SC-Ura-His-Leu+Glucose培養基上生長，說明AhGPAT5B、AhGPAT7A/B具有酰基轉移酶活性（圖4）。將轉AhGPAT5B、AhGPAT7A/B的酵母雙突變體進行濃度梯度稀釋培養后，發現它們均能很好地恢復酵母雙突變體ZAFU1在葡萄糖培養基上的生長（圖5）。轉AhGPAT8A的ZAFU1酵母在SC-Ura-His-Leu+Glucose上有少數幾個酵母菌落生長，其功能有待進一步探究。將AhGPAT轉入條件致死型酵母雙突變體ZAFU1中，從葡萄糖或半乳糖培養基上挑取單個菌落稀釋（1 ∶ 5）后，分別涂布在SC-Ura-His-Leu+Glucose、SC-Ura-His-Leu+Galactose固體培養基上。

3 結論與討論

本研究從花生中分離了13個3-磷酸甘油酰基轉移酶基因，編碼的蛋白均具有?；D移酶的4個保守結構域[17]。運用酵母遺傳互補體系對AhGPAT的?；D移酶活性進行了鑒定，發現AhGPAT5B/7A/7B能恢復酵母雙突變體ZAFU1在葡萄糖培養基中的生長，表明其具有酰基轉移酶活性。

擬南芥AtGPAT1具有?；D移酶活性，而花生AhGPAT1A、AhGPAT1B在酵母遺傳互補體系中均不能恢復酵母雙突變體ZAFU1的生長，AhGPAT1A/B與AtGPAT1的氨基酸相似度分別只有65.8%、66.1%，AhGPAT1A/B與AtGPAT1的氨基酸序列差異較大，目前尚不清楚這些序列差異是否影響了AhGPAT1A/B的酰基轉移酶活性。

根據前人的研究及花生基因組數據庫信息，AhGPAT5、AhGPAT7在根、花中的表達量較高，但是這些基因在種子中的表達量較低，而花生根和花的油脂含量低[11]。目前尚不清楚這些基因是否參與種子中油脂、膜脂合成，AhGPAT5、AhGPAT7的功能差異有待進一步探究。

參考文獻：

[1]dos Santos Maraschin F，Kulcheski F，Segatto A，et al. Enzymes of glycerol-3-phosphate pathway in triacylglycerol synthesis in plants：function，biotechnological application and evolution[J]. Progress in Lipid Research，2019，73：46-64.

[2]Durrett T P，Benning C，Ohlrogge J B. Plant triacylglycerols as feed stocks for the production of biofuels[J]. The Plant Journal，2008，54（4）：593-607.

[3]萬書波. 我國花生產業面臨的機遇與科技發展戰略[J]. 中國農業科技導報，2009，11（1）：7-12.

[4]許婷婷，宮清軒，江 晨，等. 我國花生產業的發展現狀與前景展望[J]. 山東農業科學，2010（7）：117-119.

[5]Li-Beisson Y H，Shorrosh B，Beisson F，et al. Acyl-lipid metabolism[J]. Arabidopsis Book，2013（11）：e0161

[6]Wang L P，Shen W Y，Kazachkov M，et al. Metabolic interactions between the Lands cycle and the Kennedy pathway of glycerolipid synthesis in Arabidopsis developing seeds[J]. The Plant Cell，2012，24（11）：4652-4669.

[7]Waschburger E，Kulcheski F R，Veto N M，et al. Genome-wide analysis of the glycerol-3-phosphate acyltransferase （GPAT） gene family reveals the evolution and diversification of plant GPATs[J]. Genetics and Molecular Biology，2018，41（suppl 1）：355-370.

[8]Shockey J，Regmi A，Cotton K，et al. Identification of Arabidopsis GPAT9 （At5g60620） as an essential gene involved in triacylglycerol biosynthesis[J]. Plant Physiology，2016，170（1）：163-179.

[9]Kunst L，Browse J，Somerville C. Altered regulation of lipid biosyn thesis in a mutant of Arabidopsis deficient in chloroplast glycerol-3-phosphate acyltransferase activity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1988，85（12）：4143-4147.

[10]Singer S D，Chen G，Mietkiewska E，et al. Arabidopsis GPAT9 contributes to synthesis of intracellular glycerolipids but not surface lipids[J]. Journal of Experimental Botany，2016，67（15）：4627-4638.

[11]郝翠翠，梁成偉，石 蕾，等. 花生甘油-3-磷酸酰基轉移酶（GPAT）基因的克隆及表達分析[J]. 花生學報，2018，47（1）：1-10，18.

[12]Chi X Y，Yang Q，Pan L，et al. Isolation and expression analysis of glycerol-3-phosphate acyltransferase genes from peanuts（Arachis hypogaea L.）[J]. Grasasy Aceites，2015，66（3）：e093.

[13]Lei J，Miao Y C，Lan Y，et al. A novel complementation assay for quick and specific screen of genes encoding glycerol-3-phosphate acyltransferases[J]. Frontiers in Plant Science，2018，9：353.

[14]陳丹丹，劉宏波. 篩選GPAT基因的酵母遺傳互補體系的優化[J]. 江蘇農業科學，2019，47（13）：64-66.

[15]李向陽，湯 宏，張國輝. 比較基因組分析斯氏假單胞菌遺傳多樣性及固氮基因島進化機制[J]. 江蘇農業科學，2017，45（1）：33-38.

[16]禹海鑫，安榆林，郭驍駒，等. 不同種類白條天牛基因條形碼特征與系統發育初探[J]. 江蘇農業科學，2017，45（13）：90-94.

[17]Lewin T M，Wang P，Coleman R A. Analysis of amino acid motifs diagnostic for the sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase reaction[J]. Biochemistry，1999，38（18）：5764-5771.