莖瘤芥餅粕中硫苷的酶解條件優化

張燕 張欣欣

摘要：用硫脲比色法、紫外分光光度法測定莖瘤芥餅粕中異硫氰酸酯的生成量，并以此為評價指標，設計單因素試驗和正交試驗，研究莖瘤芥（俗稱榨菜）餅粕中的硫苷在外源黑芥子酶催化作用下生成異硫氰酸酯的影響因素，從而確定硫苷酶解的最佳條件。單因素試驗探究不同料液比（1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 15 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 25 mL、1 g ∶ 30 mL）、酶解時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h）、溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）及pH值（2、3、4、5、6、7、8、9）對異硫氰酸酯生成量的影響。根據單因素試驗的結果，選取對餅粕中異硫氰酸酯生成量影響較為顯著的料液比、酶解溫度、時間及pH值進行正交試驗設計，對硫苷的酶解條件進行優化。正交試驗結果表明，硫苷酶解的最適條件如下：酶解時間為1.0 h、反應溫度為60 ℃、反應體系pH值為6、料液比為1 g ∶ 15 mL，在該條件下，異硫氰酸酯的生成量達到最大值，為1.485 mg/g。通過研究，確定了莖瘤芥餅粕中硫苷酶解的最佳條件，從而為人類研發出更具有經濟價值和功能價值的產品提供了數據參考，提高了莖瘤芥的綜合利用效率。

關鍵詞：莖瘤芥;硫苷;異硫氰酸酯;酶解條件

中圖分類號： S188+.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0238-05

硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷）是十字花科蔬菜中一類重要的含硫次級代謝產物。近年來的研究表明，十字花科植物對癌癥有一定的療效，并且發現這種抗癌物質是硫苷的降解產物或其相關的衍生物，其中最主要的是異硫氰酸酯（ITC）。異硫氰酸酯可以形成辛辣的風味，如芥菜的特殊辛辣味與烯丙基異硫氰酸鹽有關[1]。同時研究表明，硫苷的降解產物異硫氰酸酯還可以抑制細菌的生長，其原因主要是異硫氰酸酯可以使細菌的細胞膜通透性改變[2]。由于異硫氰酸酯具有多種生物學活性，因此若能將其成功地應用于醫學上癌癥的治療以及食品的加工和貯藏，將對人類具有積極的影響。目前，全世界死于癌癥的人數不斷增加，癌癥已經成為全世界科學家重點攻克的對象，而異硫氰酸酯具有抗癌的生物活性，這對人類攻克癌癥、延長壽命找到了1個可行的切入點。同時，在食品的加工上，異硫氰酸酯可以形成辛辣的風味，使食品的味道更加鮮美。在貯藏上，異硫氰酸酯的抑菌作用，使食品的保質期延長，貯藏的時間更久。這些都對人類的生活產生了巨大的經濟效益。莖瘤芥（俗稱榨菜）是屬于十字花科的蕓薹屬植物，研究發現，硫苷在蕓薹屬植物中的含量是最豐富的，因而根據區域特色作物來探究硫苷的酶解條件并進行優化，將更有利于地方經濟的發展，并可為藥物的開發提供數據參考。

1 硫苷及其降解產物的研究現狀

硫苷在植物細胞中主要以離子的形式存在，尚毅等總結了硫代葡萄糖苷的研究進展，結果顯示，硫苷的結構由3個部分構成：硫代糖苷鍵、磺酸根和側鏈基團[3]。目前已經發現，在植物中含有120多種硫苷[4]，這些硫苷在結構組成上存在的差異主要是由于側鏈R基團的不同。根據側鏈R基團結構的不同，可以把硫苷分為以下3大類：含有直鏈或支鏈烷基的脂肪族硫苷、含有苯環的芳香族硫苷以及含有吲哚環的吲哚族硫苷。其中異亮氨酸、甲硫氨酸主要構成脂肪族硫苷的側鏈，酪氨酸、苯丙氨酸主要構成芳香族硫苷的側鏈，而色氨酸構成吲哚族硫苷的側鏈[5]。程坤等研究發現，硫苷在十字花科植物中的種類與含量占顯著優勢，其含有硫苷的種類占目前已經發現的120多種硫苷的絕大部分，而在植物的其他科、屬中只發現含有1種或其中幾種硫苷，所含硫苷種類的數量遠不及十字花科植物的多[6]。硫苷廣泛分布在植物的根、莖、葉和種子等部位，但是在種子中硫苷的含量是最高的[7]。王科研究發現，在十字花科植物的種子中含有的硫苷量可高達植物干質量的10%;而在其他部位中，硫苷的含量僅占植物干質量的1%左右[8]。硫苷的種類及其相應的組分含量在不同植物中具有顯著的差異，當植物處于不同的地理環境或在不同的生物階段中，就算是同一種植物的不同品種，各品種間所含有的硫苷種類和組分含量各不相同[9]。例如，在西蘭花中的硫苷主要是4-甲基亞磺酰酸基丁基硫苷、3-烯丁基硫苷和3-吲哚甲基硫苷;而在白菜中的硫苷則以2-烯丙基硫苷、3-吲哚甲基硫苷為主[10]。修麗麗等對西蘭花的嫩芽進行檢測發現，4-甲基亞磺酰酸基丁基硫苷的含量是植株成熟時的100倍[11]。硫苷在黑芥子酶的催化作用下會發生相應的酶解反應，黑芥子酶是水解硫苷的專一酶，它是一種二聚體蛋白質，其相對分子質量在59～75 ku[12]之間。在植物細胞中，硫苷并不是獨立存在的，而是以硫苷-黑芥子酶這種體系的形式存在的[13]。在植物未受到損傷的狀態下，細胞中的硫苷、黑芥子酶是相互分隔開的，它們之間有1道天然的屏障。硫苷存在于植物細胞的液泡中[14]，液泡具有1層生物膜，這層液泡膜將形成硫苷與黑芥子酶之間的生物屏障。在正常情況下，硫苷與黑芥子酶并不會互相接觸而發生酶解反應，只有當植物細胞受到損傷或破壞時，硫苷與黑芥子酶之間的液泡膜屏障被破壞，才會相互聚集到一起，從而在酶的作用下發生催化反應，產生一系列的代謝產物，例如，生成1個糖苷配基以及1分子葡萄糖[15]。其中糖苷配基非常不穩定，會自發排列重新組合生成不同的降解產物。得到的降解產物不僅與硫苷的結構組成有關，而且與反應條件有關。當反應體系的pH值為中性時，糖苷配基會通過重新排列生成較穩定的，并且具有生物活性的異硫氰酸酯;當反應體系的pH值為酸性時，糖苷配基發生脫硫反應，從而得到腈類化合物;當反應體系的pH值為堿性時，糖苷配基將重新排列生成硫代氰酸鹽[16]。近年關于硫苷降解產物的研究發現，其產物具有多種醫用價值和藥用價值，尤其是硫苷的酶解產物異硫氰酸酯具有抗癌作用。申樹芳等的研究表明，異硫氰酸酯的抗癌機制主要是異硫氰酸酯可以使谷胱甘肽轉硫酶、UDP（尿苷二磷酸）-葡萄糖醛酸轉移酶的活性提高[17]。UDP-葡萄糖醛酸可與藥物或者與含有羥基、羧基、氨基、硫基等的有害化學物質結合，生成可溶于水的化合物，并隨著尿液排出，使機體中對基因損傷的化學物質減少，因此降低了基因的突變率。鮑英慧對油菜籽餅粕中異硫氰酸酯的測定方法[18]，為本研究中異硫氰酸酯的測定提供了參考。

2 本研究的創新點

本研究的試驗材料是莖瘤芥雜交種涪雜2號的種子，涪雜2號是重慶市涪陵區的特色作物，該地區擁有豐富的榨菜資源和天然的地理條件。目前，大部分研究者對西蘭花、油菜、芥菜中硫苷及硫苷酶的研究較多，同時選取的材料大多是植物的根、莖、葉等組織，對種子中硫苷的酶解條件優化研究較少。

3 材料與方法

3.1 材料

本研究所用材料為由涪陵莖瘤芥（榨菜）研究所研制的莖瘤芥雜交種涪雜2號的種子。

3.2 試劑

主要試劑為丙酮、檸檬酸、磷酸氫二鈉、80%氨乙醇（量取20 mL氨水與80 mL無水乙醇后充分混勻）。pH值為7.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖溶液。二氯甲烷、氨水、無水乙醇，購自重慶真真化工有限公司。

3.3 主要儀器與設備

JJ-2B型電動高速搗碎機，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;QL-901渦旋混合器，江蘇省海門市麒麟醫用儀器廠;CS101-2EBN電熱鼓風干燥箱，重慶市恒達儀器廠;離心機，湖南凱達科學儀器有限公司;恒溫水浴鍋，江蘇榮華儀器制造有限公司;紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

3.4 試驗方法

3.4.1 莖瘤芥籽餅粕的提取 將涪雜2號種子（48 h內的發芽率必須大于85%，且保存期不超過1年）粉碎后，稱取適量榨菜籽餅粕，過60目篩，留下篩出的部分，并在50 ℃電熱鼓風干燥箱中干燥，干燥后存放于干燥器中，備用。

3.4.2 黑芥子酶的粗制酶粉提取 按文獻[19]描述的方法提取黑芥子酶的粗制酶粉。（1）將涪雜2號種子（48 h內的發芽率必須大于85%，且保存期不超過1年）經電動高速搗碎機粉碎，粉碎得越細越好，可以經過多次粉碎。（2）稱取100 g粉碎過的榨菜籽，每次用30 mL丙酮進行脫脂處理，一共進行10次脫脂處理，共耗用300 mL丙酮。（3）用濾紙過濾，留取過濾在燒杯中的脫脂榨菜籽粉，在電熱鼓風干燥箱中干燥。干燥過后，用400 mL蒸餾水分2次來提取脫脂粉中的黑芥子酶。（4）再進行離心，取上層混懸液體，在混懸液中加入 400 mL 丙酮將黑芥子酶沉淀出來，然后將上清液棄去，留下沉淀。之后再用丙酮洗滌沉淀，共洗滌5次。（5）將洗滌好的沉淀進行離心，棄去上清液，留下層的沉淀物，將沉淀物在電熱鼓風干燥箱內進行干燥，待干燥過后，將其研磨成粉末，裝入密封的干燥瓶中，保存在4 ℃冰箱中備用。

3.4.3 硫苷酶解生成異硫氰酸酯含量的測定 準確稱取 0.200 g 榨菜籽餅粕于試管中，向試管中加入40 mg粗黑芥子酶、2.0 mL pH值為7.0的緩沖液。將試管放在渦旋混合器上，使試管中的反應物充分混合。將反應物放在不同的酶解條件下，酶促反應2 h。待酶解過后向試管中加入2.5 mL二氯甲烷，再用渦旋混合器進行充分混勻，混勻后將試管放在室溫下振蕩，頻率為40 kHz，時間為1 h。之后再用渦旋混合器將試管中的水相、有機相、樣品進行充分混合，將混勻后的樣液裝入待離心的試管中，在離心機中于4 000 r/min離心 20 min。取具塞試管，向試管中加入6 mL 80%氨已醇。用移液槍取離心管下層的有機相樣液50 μL，將其加入盛裝80%氨已醇的試管中，蓋上塞子。用渦旋混合器將試管中的液體混合均勻，再將試管放入50 ℃水浴鍋中，加熱0.5 h，取出試管，待其冷卻至室溫。最后用紫外分光光度計測定其吸光度（波長為245 nm）。每個試樣需要平行測定3次，求出其算術平均值。

3.5 單因素酶解條件的確定

準確稱取0.200 g榨菜籽餅粕，向其中加入40 mg外源黑芥子酶。研究不同料液比（1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 15 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 25 mL、1 g ∶ 30 mL）、時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h）、溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、pH值（2、3、4、5、6、7、8、9）對異硫氰酸酯生成量的影響。

3.6 正交設計試驗的確定

莖瘤芥餅粕中的硫苷會在黑芥子酶的作用下降解生成異硫氰酸酯。根據單因素試驗結果，選擇對異硫氰酸酯生成量相對影響較高的3個水平進行正交試驗設計（表1），以此來對莖瘤芥餅粕中硫苷的酶解條件進行優化。

3.7 異硫氰酸酯含量的計算公式

本試驗用李培武等的測定油菜餅粕中異硫氰酸酯的硫脲比色法[20]來計算異硫氰酸酯的含量，相關公式如下：

c=D245 nm-D235 nm+D255 nm2×28.55。

式中：c為異硫氰酸酯的含量。

4 結果與分析

4.1 單因素試驗的結果與分析

4.1.1 不同料液比對異硫氰酸酯生成量的影響 由圖1可以看出，料液比對異硫氰酸酯生成量的影響趨勢如下：隨著料液比增加，異硫氰酸酯的生成量先增加，當異硫氰酸酯的生成量達到最大值時，此時的料液比為1 g ∶ 15 mL，在添加外源黑芥子酶的條件下，測得異硫氰酸酯的生成量為0.83 mg/g;隨著料液比的不斷提高，異硫氰酸酯的生成量降低并逐漸趨于平穩，料液比為1 g ∶ 25 mL、1 g ∶ 30 mL時的異硫氰酸酯生成量分別為0.66、0.64 mg/g。由于硫苷的生物降解需要水分子的參與，當料液比較低時，硫苷在磷酸鹽-檸檬酸緩沖液中溶解的量較少，導致硫苷酶解生成異硫氰酸酯的量也很小。之后，隨著料液比的增加，硫苷在緩沖液中的溶解量達到最大值，于是硫苷降解生成異硫氰酸酯的量最高。最后，由于反應體系中添加的黑芥子酶量有限，隨著料液比的提高，異硫氰酸酯的生成量并不會隨之提高，逐漸趨向于平穩。

4.1.2 不同溫度對異硫氰酸酯生成量的影響 由圖2可以看出，當酶解溫度為30 ℃時，異硫氰酸酯的生成量較少，為0.38 mg/g，之后隨著溫度的升高，異硫氰酸酯的生成量逐漸增加。當溫度為60 ℃時，異硫氰酸酯的生成量達到最大值;在添加外源黑芥子酶的條件下，測得異硫氰酸酯的生成量為0.54 mg/g;當溫度超過60 ℃后，異硫氰酸酯的生成量又逐漸減少。可以看出，溫度對異硫氰酸酯生成量的影響趨勢總體是先升高，達到最大值后又逐漸降低。當溫度較低時，黑芥子酶的活性也比較低，于是硫苷酶解產物異硫氰酸酯的生成量較少。當溫度達到黑芥子酶的最適溫度60 ℃時，此時黑芥子酶的活性達到最大值，硫苷降解產物異硫氰酸酯的生成量最高。之后隨著溫度的繼續升高，由于高溫在一定程度上會破壞黑芥子酶的空間結構，使黑芥子酶變性失活，從而導致異硫氰酸酯的生成量減少。

4.1.3 不同時間對異硫氰酸酯生成量的影響 由圖3可以看出，硫苷酶解1 h后，異硫氰酸酯的生成量達到最大值，在添加外源黑芥子酶的條件下，測得異硫氰酸酯的生成量為 1.02 mg/g，隨著時間逐漸增加，異硫氰酸酯的生成量又逐漸減少，當酶解5 h時，在添加外源黑芥子酶的條件下測得異硫氰酸酯的生成量為0.32 mg/g，比酶解1 h時降低了 0.70 mg/g。隨著酶解時間的延長，異硫氰酸酯的穩定性降低，與反應體系中含有的親核基團如羥基、氨基等物質發生加成反應，導致異硫氰酸酯的生成量減少。

4.1.4 不同pH值對異硫氰酸酯生成量的影響 由圖4可以看出，硫苷的酶解產物異硫氰酸酯在pH值為5～7的環境中生成量較高，當體系的pH值為6時，異硫氰酸酯的生成量達到最大值，在添加外源黑芥子酶的條件下，測得異硫氰酸酯的生成量為0.77 mg/g，而在過酸或過堿的環境中，異硫氰酸酯的生成量較少。在pH值為2、9的環境中，生成的異硫氰酸酯的量分別為0.34、0.31 mg/g，分別比pH值為6的環境中的pH值降低了0.43、0.46 mg/g。當反應體系的pH值為 2～4 時，處于過酸的環境中，黑芥子酶的活性受到抑制，因此硫苷酶解生成異硫氰酸酯的量較少。當反應體系的pH值為中性或偏酸性時（pH值為5～7），黑芥子酶的活性較高，因而異硫氰酸酯的生成量較高。當反應體系的pH值為8～9時，黑芥子酶的活性降低，導致異硫氰酸酯的生成量較少。

4.2 正交設計試驗的結果與分析

正交設計試驗的結果與分析見表2、表3。由表3可以看出，時間和溫度的P值為0.01～0.05，說明時間和溫度對異硫氰酸酯生成量的影響達到顯著水平，在其F值的右上方標記“*”;pH值和料液比的P值<0.01，說明pH值和料液比對異硫氰酸酯生成量的影響達到極顯著水平，在其F值的右上方標記“**”。通過F值的大小可以看出，影響莖瘤芥餅粕中硫苷酶解的因素主次排序是料液比（D）>pH值（C）>時間（A）>溫度（B）。由表2可以看出，A1B2C3D2為硫苷酶解的最佳組合，但是在正交設計組合中并沒有這一組合。在單因素試驗中，異硫氰酸酯的生成量在C2條件下（pH值為6）比C3條件下（pH值為7）的高。因此結合單因素及正交設計試驗的結果，得出A1B2C2D2這一組合為硫苷酶解的最佳組合。進一步得出莖瘤芥餅粕中硫苷的最佳酶解條件如下：時間為1 h，溫度為60 ℃，pH值為6，料液比為1 g ∶ 15 mL。在添加外源黑芥子酶的條件下，測得異硫氰酸酯的生成量為1.485 mg/g。

5 討論

莖瘤芥餅粕中硫苷的生物降解主要依靠黑芥子酶，同時適當的緩沖液會使黑芥子酶在緩沖液中的活性提高。張蕾等研究者在提取西蘭花籽中的黑芥子酶時，得出在Tris-HCl緩沖液中，黑芥子酶的活性比在蒸餾水和其他緩沖液中的都高，其次是在磷酸鹽-檸檬酸緩沖液中的活性，但是在蒸餾水中黑芥子酶活性是最低的[21]。該研究結果對本試驗選取適當的緩沖液奠定了基礎。趙振東在海南芥子中硫苷及其酶解產物的提取分離與鑒定中，發現Tris中含有的氨基會與硫苷的酶解產物異硫氰酸酯發生相應的加成反應[22]。這對本試驗最終測定異硫氰酸酯的生成量有影響，于是本研究選取磷酸鹽-檸檬酸緩沖液作為研究的緩沖液。劉哲等對蘿卜硫苷合成和調節相關基因的研究表明，硫代葡萄糖苷屬于陰離子親水性類物質，因此硫苷發生生物降解需要在有水分子的環境中[23]。丁艷等在油菜籽餅粕中硫苷的酶解條件優化及降解產物分析中發現，料液比對異硫氰酸酯生成量影響的總體趨勢如下：先升高，當料液比為1 g ∶ 15 mL時，異硫氰酸酯的生成量達到最大值，之后下降，最后趨向于平穩[13]，這與本研究結果基本相符合。劉月萍在黑芥子酶提取分離、性質及固定化的研究中發現，使硫苷發生降解的專一黑芥子酶，其對溫度的穩定性可以達到65 ℃[24]。在本研究中，當溫度為60 ℃時，黑芥子酶的活性最高，本研究中黑芥子酶的最適溫度在其穩定的區間內。張清峰在辣根中生物活性成分——異硫氰酸酯的研究中發現，當溫度偏高時，異硫氰酸酯的穩定性會降低，同時會與溶液中存在的OH-發生反應，導致實際測得的異硫氰酸酯量減少[25]。在本研究中，當溫度為 80 ℃ 時，異硫氰酸酯的實際量顯著較低，與張清峰的研究結論基本相符。在酶解時間方面，隨著酶解時間延長，異硫氰酸酯的穩定性下降，反應體系中含有的親核基團如氨基、羥基等物質發生加成反應，導致異硫氰酸酯的生成量減少，這與丁艷等得出的時間對異硫氰酸酯的影響規律[13]基本相符。在硫苷酶解的最適pH值方面，本研究得出的結論和其他學者的研究結論有一定的差異。蘇光耀等在西蘭花籽中硫代葡萄糖苷酶解條件的研究中發現，當反應體系的pH值為4.0時，在西蘭花籽中硫苷酶解生成異硫氰酸酯的量是最高的[26]。陳紅霞在辣根中異硫氰酸酯的制備和活性研究中發現，當反應體系的pH值為7.0時，在辣根中硫苷酶解生成異硫氰酸酯的量達到最大值[27]。在本研究中得出莖瘤芥餅粕中硫苷酶解的最佳pH值為6，此時生成的異硫氰酸酯的量最高。分析其主要原因，是研究的材料不同，本研究的材料是重慶市涪陵區的特色區域作物莖瘤芥雜交種的涪雜2號，同時是以涪雜2號的種子為原料。研究發現，材料取自不同的植物，甚至植物的不同組織部位時，黑芥子酶的活性都存在一定差異。因此本研究與其他學者的研究得出的最適pH值有所不同是符合植物生理規律的。但是本研究得出，莖瘤芥餅粕中硫苷酶解的最適pH值為6，與郭強暉在西蘭花芽苗異硫氰酸酯富集與調控技術中研究發現的黑芥子酶的活性在pH值為5～8的區間內較高這一總體規律是基本相符的[28]。

6 結論

本研究得出莖瘤芥餅粕中硫苷的最佳酶解條件如下：時間為1 h，溫度為 60 ℃，pH值為6，料液比為1 g ∶ 15 mL。在添加外源黑芥子酶的條件下，測得異硫氰酸酯的生成量為1.485 mg/g。本研究確定了莖瘤芥餅粕中硫苷的最佳酶解條件，為研發出更具有經濟價值和功能價值的產品提供了數據參考，提高了莖瘤芥的綜合利用效率。

參考文獻：

[1]肖華志. 食用辛辣風味物質異硫氰酸烯丙酯（AITC）的研究[D]. 北京：中國農業大學，2004：10-100.

[2]陳蘭英，畢明芳，余 倩，等. 異硫氰酸酯的分析方法[J]. 化學世界，2014，55（5）：307-310.

[3]尚 毅，田建華，李殿榮. 硫代葡萄糖苷的研究進展[C]//食物與能源安全戰略中的中國油料——中國作物學會油料作物專業委員會第五屆學術年會論文集. 上海，2004：668-679.

[4]翟志亭. 氨基酸對甘藍硫代葡萄糖苷組分及含量的影響[D]. 南京：南京農業大學，2008：6-76.

[5]梁 浩，李瑞敏，袁其朋. 天然活性異硫氰酸酯類化合物的研究進展[J]. 北京化工大學學報（自然科學版），2015，42（2）：1-12.

[6]程 坤，楊麗梅，方智遠，等. 十字花科植物中主要硫代葡萄糖苷合成與調節基因的研究進展[J]. 中國蔬菜，2010，1（12）：1-6.

[7]周政子. 蘿卜籽中硫代葡萄糖苷的提取純化及其降解產物的抑菌特性研究[D]. 杭州：浙江工商大學，2013：3-79.

[8]王 科. 基于低速逆流色譜法的蘿卜籽中硫代葡萄糖苷的制各分離[D]. 杭州：浙江工商大學，2008：3-76.

[9]邱海榮. 不同品種青花菜和花椰菜硫代葡萄糖苷含量的測定及比較[D]. 南京：南京農業大學，2008：7-64.

[10]李 鮮，陳昆松，張明方，等. 十字花科植物中硫代葡萄糖苷的研究進展[J]. 園藝學報，2006，33（3）：675-679.

[11]修麗麗，鈕昆亮. 十字花科植物中的硫代葡萄糖苷及其降解產物[J]. 浙江科技學院學報，2004，16（3）：187-189，211.

[12]朱 磊. 十字花科植物種子黑芥子酶酶學性質研究[D]. 北京：北京化工大學，2011：6-87.

[13]丁 艷，李麗倩，曹 蓉，等. 油菜籽餅粕中硫苷的酶解條件優化及降解產物分析[J]. 中國農業科學，2014，47（2）：383-393.

[14]阮 穎，周樸華，劉春林. 植物硫代葡萄糖苷-黑芥子酶底物酶系統[J]. 湖南農業大學學報（自然科學版），2007，33（1）：18-23，78.

[15]劉 楠. 黑胡蘿卜色素的提取純化及其結構分析[D]. 天津：天津科技大學，2007：4-74.

[16]李 雷，鄒 翔，季宇彬. 十字花科植物中異硫氰酸鹽的性質及活性研究[J]. 哈爾濱商業大學學報（自然科學版），2007，23（4）：385-389，399.

[17]申樹芳，張英鋒，馬子川. 西蘭花中硫代葡萄糖苷的抗癌藥理[J]. 化學教學，2009，2（7）：64-65.

[18]鮑英慧. 比色法測定菜籽餅粕中異硫氰酸酯[J]. 中國飼料，1999（24）：13.

[19]汪 儆，雷祖玉，馮學勤，等. 飼料中異硫氰酸酯的測定方法：GB 13087—1991[S]. 北京：中國標準出版社，1991.

[20]李培武，張 文，丁小霞，等. 油菜餅粕中異硫氰酸酯的測定硫脲比色法：NY/T 1596—2008[S]. 2008.

[21]張 蕾，龐秋穎，王 洋. 黑芥子酶提取及活性測定方法的改進[J]. 東北師大學報（自然科學版），2011，43（1）：118-121.

[22]趙振東. 海南芥子中硫苷及其酶解產物的提取分離與鑒定[D]. 海口：海南大學，2013：4-77.

[23]劉 哲，張秋萍，蘇小俊，等. 蘿卜硫苷合成和調節相關基因研究進展[J]. 江蘇農業科學，2015，43（6）：168-170.

[24]劉月萍. 黑芥子酶提取分離、性質及固定化研究[D]. 杭州：浙江工商大學，2007：3-74.

[25]張清峰. 辣根中生物活性成分——異硫氰酸酯的研究[D]. 天津：天津商業大學，2007：4-97.

[26]蘇光耀，沈蓮清，王向陽，等. 西蘭花籽中硫代葡萄糖苷酶解條件的研究[J]. 中國糧油學報，2008，23（2）：178-182.

[27]陳虹霞. 辣根中異硫氰酸酯的制備和活性研究[D]. 北京：中國林業科學研究院，2009：5-106.

[28]郭強暉. 西蘭花芽苗異硫氰酸酯富集與調控技術研究[D]. 南京：南京農業大學，2014：7-77.