牛蒡復合乳酸菌發酵飲料工藝優化及穩定性研究

馬艷弘 孟勇 崔晉

摘要：以牛蒡為主要原料，篩選適宜其發酵的復合乳酸菌，制備牛蒡發酵飲料。在單因素試驗基礎上，通過正交試驗優化其發酵工藝與穩定劑配方，分析其抑菌活性。結果表明，明串珠菌和植物乳桿菌SD2為適宜的發酵菌種，牛蒡乳酸菌飲料的最佳發酵工藝：料液比為1 g ∶ 6 mL，復合乳酸菌菌種配比（體積比）為1 mL ∶ 1 mL，接種量為6%，發酵溫度為41 ℃，發酵時間為60 h;復合穩定劑配方：黃原膠用量為0.10%、果膠用量為0.30%、結冷膠用量為0.20%。該工藝條件下制備的牛蒡發酵飲料具有較好的口感、穩定性和明顯的抗菌活性。

關鍵詞：牛蒡;乳酸菌;發酵飲料;穩定性;抑菌活性;正交試驗

中圖分類號： TS275.4 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0243-04

牛蒡（Arctium lappa L.），又名惡實、大力子、東洋參，牛鞭菜等，屬桔梗目菊科二年生草本植物。牛蒡富含人體所需的多種氨基酸、維生素及礦物質，還含有菊糖、揮發油、牛蒡苷、多酚、膳食纖維等多種生理活性物質[1-3]，具有明顯的降血脂、降血糖、潤腸通便、抗癌、保護心腦血管、提高人體免疫力等功效[4-6]。但是因牛蒡含有多種烯、酮、醛、不飽和烴類等揮發性成分[7]，致使其產品通常帶有令人不愉悅的刺激風味，嚴重制約了牛蒡產業發展及其相關產品的市場銷量。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）作為一類發酵糖產生乳酸的革蘭氏陽性細菌，是人和動物體腸道內天然存在的重要益生菌群，有防止乳糖不耐癥、改善人體胃腸功能、促進消化、抗菌消炎、抑制膽固醇代謝、降血脂、降血壓、抗衰老、免疫調節等生物保健功能[8]。大多數乳酸菌具有食用安全性[9]，已被廣泛應用于發酵果蔬、乳品加工等食品領域。研究報道，乳酸菌發酵能夠將蔬菜蛋白質降解為氨基酸、多肽等小分子物質，釋放多酚、黃酮等功能因子[10]，合成維生素B、維生素K等果蔬中缺乏的維生素[11]，并能伴隨發酵過程生成新的有機酸、胞外多糖、γ-氨基丁酸等生理活性物質，不僅可顯著提高蔬菜的營養價值與生物利用度，還能夠形成其獨特的色香味，加速含硫和含氮等不良風味物質的降解，從而改善發酵原料的風味及品質[12-14]。

目前乳酸菌發酵飲料已經成為食品加工領域的研究熱點之一，但是市場上蔬菜原漿發酵飲料多采用自然發酵的方式，具有發酵周期長、發酵風味差、質量不穩定、標準化程度低等缺陷，有關牛蒡復合乳酸菌發酵技術及其產品的研究也鮮有報道。因此，本研究以牛蒡為主要原料，篩選出發酵啟動快和具有良好產酸能力的復合乳酸菌發酵牛蒡漿，在單因素試驗的基礎上利用正交試驗優化復合乳酸菌發酵牛蒡的最佳工藝及其穩定劑配方，并分析牛蒡發酵飲料的抗菌能力，既為擴寬牛蒡加工途徑、改善現有牛蒡產品的風味與品質提供科學依據，也為進一步的產業化生產提供技術參數。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株與試劑 保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophiles）、明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、植物乳桿菌SD2（Lactobacillus plantarum SD2）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella typhimurium）等均由江蘇省農業科學院農產品加工研究所食品生物工程研究室保藏。

牛蒡根由徐州世緣食品有限公司提供;MRS和PDA培養基均購自南京天為生物科技有限公司;氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、葡萄糖、三羥甲基胺基甲烷（Tris）、鹽酸均為分析純試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司;黃原膠、結冷膠、果膠均為市售食品級。

1.1.2 儀器與設備 BS323S型電子天平，購自賽多利斯科學儀器北京有限公司;HWSY型電熱恒溫水浴鍋，購自浙江舟山市定海區海源儀器廠;D-8型紫外可見分光光度計，購自上海奧析科學儀器有限公司;BHC-1300IIA/B2型生物潔凈安全柜，購自蘇州凈化設備有限公司;TDL-80-2C低速臺式離心機，購自上海安亭科學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛蒡復合乳酸菌發酵飲料制備工藝 牛蒡漿的制備：將新鮮牛蒡洗凈，去皮切片后以1 ∶ 2～1 ∶ 6的固液比于1%（質量比）檸檬酸、0.5%維生素C、0.6% NaCl溶液組成的護色液[15]中浸泡20 min，撈出沖洗，用90 ℃熱水燙漂10 min，再按一定料液比加水打漿，加入2%蔗糖、2%乳糖、1.5%豆粕粉，混合均勻后在121 ℃條件下高壓滅菌20 min，得牛蒡漿。

發酵劑制備：將4種乳酸菌的保藏菌種分別置于MRS培養基中進行活化復壯后，再按2%接種量接種于50 mL牛蒡漿、10 g脫脂乳粉組成的培養液中，置于培養箱30 ℃條件下培養24～48 h，連續馴化培養2～3次，至菌體濃度達1.0×108～1.0×109 CFU/mL，即為牛蒡發酵飲料的發酵劑。

牛蒡發酵飲料的制備：將備好的發酵劑于6 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清，沉淀中加入等體積的滅菌生理鹽水重懸乳酸菌后按照4%接種量接入滅菌牛蒡漿，置于恒溫培養箱 41 ℃ 發酵培養60 h，發酵結束后用紗布過濾除去濾渣，再置于離心機中，4 500 r/min離心20 min，上清液加入5%蔗糖、2%蜂蜜與復合穩定劑等輔料，混合均勻，再經灌裝、巴氏殺菌、冷卻貼標后即為成品。

1.2.2 乳酸菌發酵牛蒡漿單因素試驗 考察保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、明串珠菌、植物乳桿菌SD2在牛蒡漿中的生長情況，通過活菌數的測定確定適宜的發酵菌種;篩選出2種不同的乳酸菌后，設置不同配比[1 mL ∶ 1 mL、1 mL ∶ 2 mL、2 mL ∶ 1 mL、2 mL ∶ 3 mL、3 mL ∶ 2 mL]的復合菌種，通過考察發酵液pH值和還原糖含量，確定復合菌種最佳配比;設置不同料液比[1 g ∶ 2 mL、1 g ∶ 4 mL、1 g ∶ 6 mL、1 g ∶ 8 mL、1 g ∶ 10 mL]、接種量（0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%）、發酵溫度（37、39、41、43、45 ℃）、發酵時間（24、36、48、60、72 h），通過考察其對乳酸含量的影響，確定適宜的發酵條件。

1.2.3 復合乳酸菌發酵牛蒡漿工藝正交試驗 在單因素試驗基礎上，以感官評分為指標，采用L9（34）進行正交試驗，對牛蒡復合乳酸菌飲料發酵工藝條件進行優化，其因素與水平見表1。

1.2.4 牛蒡乳酸菌發酵飲料的復合穩定劑篩選 以黃原膠、結冷膠、果膠為單一穩定劑，在單因素試驗基礎上，以常溫下放置3周的牛蒡乳酸菌發酵飲料經3 500 r/min離心10 min后產生的沉淀率為考察指標，通過正交試驗優化復合穩定劑配方。沉淀率越小，表明發酵飲料的穩定性越好。其中沉淀率的計算方法如下：

沉淀率=沉淀物質量/離心飲料質量×100%。

1.2.5 體外抑菌試驗[16] 將供試菌種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌從斜面轉接至已滅菌的液體馬鈴薯培養基中活化，然后分別挑取菌苔，用無菌水制成菌懸液，分別取 0.1 mL 供試菌懸液，于PDA平板培養基表面涂布均勻，用無菌鑷子夾取浸有牛蒡乳酸菌發酵飲料的濾紙片貼于各含菌平板上，以浸有無菌水的濾紙片作對照，于37 ℃培養24 h。測量各自抑菌圈直徑的大小，比較抑菌效果。

1.2.6 指標測定 乳酸菌活菌數的測定：利用生理鹽水將牛蒡發酵液進行梯度稀釋至適宜濃度，采用MRS培養基平板計數。

pH值與酸度的測定：pH值用pH計測定;總酸度以乳酸計，具體參考張宏志等的方法[17]。

還原糖含量的測定：還原糖含量采用DNS法[18]測定。以葡萄糖為標準品繪制標準曲線所得線性回歸方程為y=0.989 3x-0.010 4（r2=0.999 2），根據標準曲線即可計算樣品中還原糖含量。

感官評定：由10人組成感官評定小組對產品的色澤、組織形態、氣味、滋味進行評價記分，評分標準見表2。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選與確定

由圖1、圖2可知，不同乳酸菌在牛蒡漿中均能生長繁殖。發酵前48 h，4種乳酸菌均呈指數生長;48 h之后開始進入穩定期，發酵至60 h，各菌種的菌體數量均達到最高值，乳酸含量也達到最高;發酵60 h后各菌種的菌體數量開始緩慢下降，乳酸含量基本保持恒定。明串珠菌的發酵啟動速度最快，發酵12 h菌體數量即可達到1.26×108 CFU/mL，植物乳桿菌SD2的生長速率最快，產酸能力最強，發酵至60 h時達到菌體數量最高值，為2.63×109 CFU/mL，乳酸含量達4.32%;保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長速率較慢，整個發酵過程中，二者的菌體數量和乳酸濃度均低于相同發酵時間下的明串珠菌和植物乳桿菌SD2。因此，確定將明串珠菌和植物乳桿菌SD2復配后進行后續試驗。

2.2 菌種配比對發酵過程的影響

由圖3可知，利用不同配比的明串珠菌與植物乳桿菌SD2組成的復合菌種發酵牛蒡漿，發酵液的pH值處于 3.16～3.31之間，其中2 ∶ 1的復合菌種產酸能力最強，發酵液的pH值最低，其次分別為1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 3、3 ∶ 2的復合菌種;不同配比菌種的降糖能力也有差異，1 ∶ 1、1 ∶ 2、2 ∶ 1、2 ∶ 3、3 ∶ 2 的菌種發酵液中還原糖含量分別達3.87、4.76、4.46、4.36、4.20 mg/mL。考慮到酸度過高會對口感造成不利影響，確定降糖能力最強、還原糖濃度最低、產酸能力較強的 1 ∶ 1 乳酸菌配比作為發酵牛蒡漿最優的菌種配比。

2.3 復合乳酸菌發酵牛蒡漿單因素試驗結果

2.3.1 料液比對牛蒡發酵飲料感官評分的影響 由圖4可知，牛蒡發酵飲料的感官分值隨料液比增加呈先增加后降低的趨勢，料液比為1 g ∶ 6 mL時，感官評分最高，達92分。由此確定復合乳酸菌發酵牛蒡漿時最適料液比為1 g ∶ 6 mL。

2.3.2 接種量、發酵溫度、發酵時間對牛蒡發酵飲料乳酸含量的影響 由表3可知，牛蒡發酵飲料的乳酸含量隨接種量的增大先上升，當接種量為4.0%時達到最高值，而后保持平衡。發酵溫度在37～41 ℃范圍內，乳酸含量隨溫度升高而提高，在41 ℃時乳酸含量達到最大值，為4.33%;超過41 ℃，則又隨溫度升高而降低。發酵時間也能對牛蒡發酵飲料的產酸情況產生影響。隨著發酵時間的延長，乳酸含量呈遞增趨勢，但是超過60 h，即使發酵時間再延長，乳酸含量也基本保持不變。由此確定適宜的接種量為4%～6%，發酵溫度為 41 ℃，發酵時間為60 h。

2.4 牛蒡復合乳酸菌發酵條件正交試驗結果

在單因素試驗結果上，以乳酸含量和感官評分作為考察指標，設計L9（34）正交試驗。由表4可知，各因素對牛蒡乳酸菌發酵飲料產酸情況的影響情況表現為A>B>C，即發酵溫度> 接種量>發酵時間，最優工藝為A2B3C3，即發酵溫度為 41 ℃、接種量為6%、發酵時間為72 h;各因素對牛蒡發酵飲料感官評分的影響情況表現為A>C>B，即發酵溫度>發酵時 間> 接種量，最優發酵工藝為A2B3C2，即發酵溫度為 41 ℃、接種量為6%、發酵時間為60 h。綜合考慮乳酸產量、感官風味、生產成本，選擇A2B3C2方案為最優工藝。經驗證試驗，該條件下制備的牛蒡發酵飲料風味獨特、酸滑清爽、口感細膩、香氣協調，乳酸含量達4.41%，感官評分達93分。

2.5 牛蒡發酵飲料穩定性試驗

在前期單因素試驗基礎上，以黃原膠、果膠、結冷膠為因素，采用L9（34）正交試驗優化復合穩定劑配方，試驗結果見表5。由表5可知，各因素對牛蒡發酵飲料穩定性的影響程度表現為黃原膠>結冷膠>果膠。即對牛蒡發酵飲料穩定性影響最大的為黃原膠的用量，其次為結冷膠的用量，果膠用量對穩定性的影響最小。最優穩定劑組合為A2B3C2，即黃原膠用量為0.10%、果膠用量為0.3%、結冷膠用量為0.20%。經驗證試驗，該組合產品的離心沉淀率為2.13%，且產品外觀均勻一致，澄清透明，無沉淀，無雜質，具有優良的貯藏穩定性。

2.6 牛蒡發酵飲料的抑菌活性

抑菌圈直徑可直觀反映被測樣品對各種供試菌的抑菌能力。比較牛蒡乳酸菌發酵飲料對3種有害菌的抑菌圈直徑，結果見圖5。由圖5可知，牛蒡乳酸菌發酵飲料對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌均有明顯的抑制作用，具有潛在的廣譜抗菌活性，其對金黃色葡萄球菌的抗菌能力最強，抑菌圈直徑達15.76 mm。可能是由于乳酸菌代謝過程中產生的乳酸、乙酸等有機酸大幅降低了環境的pH值和氧化還原電位，并能產生細菌素，從而抑制或殺滅多種致病菌所致[19-20]，也可能由于牛蒡發酵飲料中的牛蒡多糖、多酚、黃酮等物質具有顯著的抑菌活性[21-22]。

3 結論

乳酸菌發酵飲料是近年來植物飲品領域的重要發展方向，其益生抗菌作用已被熟知與認可。該研究通過比較不同乳酸菌在牛蒡漿中的生長及產酸情況，篩選出發酵啟動快的明串珠菌和產酸能力強的植物乳桿菌SD2進行復合發酵，并以發酵液pH值和還原糖含量為指標，確定了復合乳酸菌的最佳配比（體積比）為1 ∶ 1。在單因素試驗基礎上，通過正交試驗確定了牛蒡發酵飲料的最佳發酵工藝：料液比為 1 g ∶ 6 mL，接種量為6%，發酵溫度為41 ℃，發酵時間為 60 h;最佳復合穩定劑配方：黃原膠用量為0.10%、果膠用量為0.30%、結冷膠用量為0.20%。在此條件下研制出的牛蒡乳酸菌發酵飲料營養豐富，風味獨特，口感酸爽，并對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌具有明顯的抗菌能力。該研究結果既可為改善牛蒡產品的風味和品質提供技術思路，也可為牛蒡發酵飲料的產業化生產提供基礎參數，具有較高的實踐應用價值。

參考文獻：

[1]顧曉明，張 圓，張曉衛，等. 牛蒡的化學成分及藥理作用研究進展[J]. 現代生物醫學進展，2013，13（16）：3179-3182.

[2]范金波，蔡茜彤，馮敘橋，等. 牛蒡根多酚和黃酮超高壓提取工藝優化及體外抗氧化活性[J]. 食品科學，2015，36（6）：69-75.

[3]胡喜蘭，許瑞波，陳 宇. 牛蒡葉多糖的提取及生物活性研究[J]. 食品科學，2013，34（2）：78-82.

[4]Ha M S，Kim J H，Kim Y S，et al. Effects of aquarobic exercise and burdock intake on serum blood lipids and vascular elasticity in Korean elderly women[J]. Experimental Gerontology，2018，101：63-68.

[5]Lou Z X，Wang H X，Wang D X，et al. Preparation of inulin and phenols-rich dietary fibre powder from burdock root[J]. Carbohydrate Polymers，2009，78（4）：666-671.

[6]趙 娜，馬維紅，蘇 贏. 牛蒡根與保護血管內皮作用的相關性研究進展[J]. 中國老年學雜志，2016，36（24）：6291-6292.

[7]葉 欣，盧金清，曹 利，等. 牛蒡子炒制前后揮發性成分的比較[J]. 中藥材，2017，40（7）：1586-1589.

[8]曹振輝，劉永仕，潘洪彬，等. 乳酸菌的益生功能及作用機制研究進展[J]. 食品工業科技，2015，36（24）：366-370，377.

[9]Arioli S，Elli M，Ricci G，et al. Assessment of the susceptibility of lactic acid bacteria to biocides[J]. International Journal of Food Microbiology，2013，163（1）：1-5.

[10]賴 婷，張名位，劉 磊，等. 龍眼果漿復合乳酸菌發酵工藝優化[J]. 農業工程學報，2016，32（增刊2）：390-397.

[11]Molina V，Médici M，de Valdez G F，et al. Soybean-based functional food with vitamin B12-producing lactic acid bacteria[J]. Journal of Functional Foods，2012，4（4）：831-836.

[12]賴 婷，劉漢偉，張名位，等. 乳酸菌發酵對果蔬中主要活性物質及其生理功能的影響研究進展[J]. 中國釀造，2015，34（3）：1-4.

[13]Palani K，Harbaum-Piayda B，Meske D，et al. Influence of fermentation on glucosinolates and glucobrassicin degradation products in sauerkraut[J]. Food Chemistry，2016，190：755-762.

[14]馬艷弘，魏建明，侯紅萍，等. 發酵方式對山藥泡菜理化特性及微生物變化的影響[J]. 食品科學，2016，37（17）：179-184.

[15]王海鷗，扶慶權，陳守江，等. 不同護色預處理對牛蒡片真空冷凍干燥特性的影響[J]. 食品科學，2017，38（1）：86-91.

[16]張宏志，馬艷弘，李亞輝，等. 乳酸菌發酵菊芋馬齒莧復合飲料及其抑菌活性[J]. 江蘇農業科學，2015，43（11）：362-365.

[17]張宏志，馬艷弘，李亞輝，等. 菊芋乳酸菌飲料生產工藝及穩定性研究[J]. 江蘇農業科學，2015，43（12）：291-294.

[18]朱凱杰，陸國權，張 遲. 響應面法優化水楊酸比色測定還原糖的研究[J]. 中國糧油學報，2013，28（8）：107-113.

[19]Han K S，Kim Y，Kim S H，et al. Characterization and purification of acidocin 1B，a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus GP1B[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，2007，17（5）：774-783.

[20]李南薇，李 寧. 乳酸菌代謝產物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制作用的研究[J]. 中國釀造，2009（5）：49-52.

[21]婁在祥. 牛蒡功能性成分及其抗氧化、抗菌活性研究[D]. 無錫：江南大學，2010：50-52.

[22]馬利華，秦衛東，陳學紅，等. 牛蒡提取物抑菌活性的研究[J]. 食品科學，2009，30（21）：24-27.