不同產地及不同年份艾葉中綠原酸含量差異分析

李超 黃顯章 張超云

摘要：采用響應面法優化艾葉綠原酸提取工藝，分析河南湯陰、河北保定、河南南陽、浙江寧波、湖北蘄春5個不同產地及2013—2017年河南湯陰艾葉中綠原酸含量的差異。結果表明，艾葉綠原酸最佳提取工藝為乙醇體積分數37%、提取時間60 min、料液比1 g ∶ 15 mL;河北保定艾葉中綠原酸含量相對最高，為10.65%，顯著高于河南湯陰、河南南陽、浙江寧波等產區（P﹤0.05）;2017年河南湯陰艾葉中的綠原酸含量相對最高，為10.22%，顯著高于2013—2016年的。5個艾葉不同主產區及2013—2017年這5個不同年份艾葉中的綠原酸含量差異相對較大，在臨床使用中應區別對待，以保證用藥的安全性和有效性。

關鍵詞：艾葉;響應面法;綠原酸;產地;年份;提取工藝

中圖分類號：R284.1 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0251-04

艾葉為菊科植物艾（Artemisia argyi Lévl. et Vant.）的干燥葉，正式作為藥物最早記載于我國梁朝陶弘景的《名醫別錄》，現收載于各版《中國藥典》中[1-2]。艾葉性辛、溫，味苦，歸肝、脾、腎經，具有溫經止血、散寒止痛、理氣安胎等功效，距今已有2 000余年的使用歷史[3-6]。在臨床應用中，艾葉內服溫經止血、散寒止痛，外用殺蟲止癢、清熱除濕，常用于治療胎漏下血、少腹冷痛、經寒不調等癥狀，是止血的要藥之一，為中醫婦科常用藥物[7-8]。隨著對艾葉研究的逐漸深入，其制品應用范圍不斷擴大，艾葉作為灸法的主體材料，是歷代醫學家們多次臨床實踐的選擇，以艾葉為主開發的艾附暖宮丸、安陽固本膏等復方中成藥也在臨床中被廣泛應用。

近年來，國內外學者對艾葉的研究主要集中在化學成分、藥理作用及臨床療效等方面[9-13]，對不同產地、不同年份間的艾葉品質差異鮮見研究報道。本試驗在利用響應面法優化艾葉綠原酸最佳提取工藝的基礎上，分析湖北蘄春、浙江寧波、河南湯陰、河北保定、河南南陽5個不同產地及2013—2017年河南湯陰艾葉中的綠原酸含量差異，以期為艾葉的質量評價提供試驗依據和有益參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

721-100型紫外可見光分光度計、SHB-DII型循環真空抽濾系統、粉碎打粉機，上海儀電分析儀器有限公司生產;DKB-507型恒溫干燥烘箱，天津市蘭博實驗儀器設備有限公司生產;DS-2120QT型超聲波清洗器，上海生析超聲儀器有限公司生產;Thermo fisher移液器，賽默飛世爾科技生產;AR-1106型電子分析天平，德國賽多利斯集團生產;4號藥典篩，湖南通用藥篩廠生產。無水乙醇，批號170506，南京國碩醫藥科技有限公司生產;綠原酸標準品，北京振翔科技有限公司生產。

1.2 樣品采集

浙江寧波、河北保定、河南湯陰、河南南陽、湖北蘄春5個產地艾葉樣品，分別于2017年端午節前后采集;2013—2017年5個不同倉儲年限艾葉樣品，分別于當年端午節前后采集于河南省湯陰縣伏道鎮。艾葉樣品采集時按照“Z”形進行，采集樣品經南陽理工學院黃顯章副教授鑒定為菊科植物艾Artemisia argyi Lévl.et Vant.。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制 精確稱取干燥至恒質量的綠原酸標準品5.50 mg，置于100 mL容量瓶中，加乙醇溶液溶解;定容，搖勻，得綠原酸對照品溶液，質量濃度為0.055 mg/mL;精確吸取綠原酸對照品溶液1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加入乙醇定容，混合均勻，采用紫外分光光度計測定波長為327 nm處的吸光度;以質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y），得到標準曲線方程為Y=8.225 9X+0.005 5（r2=0.998 8），說明綠原酸質量濃度與吸光度存在良好的線性關系。

1.3.2 艾葉綠原酸提取單因素試驗 在相對固定乙醇濃度為40%、超聲時間為60 min、料液比為1 g ∶ 15 mL、提取溫度60 ℃其中3個因子的條件下，分別考察不同乙醇體積分數、超聲時間、料液比、提取溫度對艾葉綠原酸提取率的影響。乙醇體積分數設6個梯度，分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%;超聲時間設5個梯度，分別為30、60、90、120、180 min;料液比設5個梯度，分別為1 ∶ 5、1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 30（g ∶ mL）;提取溫度設5個梯度，分別為20、40、60、80、99 ℃。

1.3.3 響應面法優化艾葉綠原酸提取工藝 在單因素試驗基礎上，按照Box-Behnken中心組合原理，以乙醇體積分數、超聲時間、料液比為考察因素，采用3因素3水平響應面分析法（-1、0、1）進行試驗設計，詳見表1、表2，以測定艾葉中綠原酸含量，優化艾葉綠原酸提取工藝。

1.3.4 不同產地、不同年份艾葉中綠原酸含量的測定 將采集的不同產地、不同年份艾葉樣品去雜、清洗，自然干燥，烘干，粉碎過篩，備用;采取響應面法得到的最佳提取工藝（乙醇體積分數37%、料液比為1 g ∶ 15 mL、提取時間60 min）提取艾葉綠原酸，取適量待測液測定波長為327 nm處的吸光度，計算艾葉中綠原酸含量及其提取率。每個樣品重復3次。

1.4 統計分析

采用Excel 2010軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 艾葉綠原酸提取的單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數對艾葉綠原酸提取率的影響 由圖1可知，隨乙醇體積分數的增加，艾葉中綠原酸提取率呈先升后降趨勢，乙醇體積分數為40%時對艾葉綠原酸的提取率相對最高，為 9.07%，這說明在一定范圍內，乙醇體積分數的增加有利于艾葉中綠原酸的提取，但其持續升高可能影響溶劑的介電性能及極性，反而會使綠原酸提取率下降。因此，艾葉綠原酸提取使用的乙醇體積分數以40%為宜。

2.1.2 超聲時間對艾葉綠原酸提取率的影響 由圖2可知，隨超聲提取時間的延長，艾葉中綠原酸提取率呈先升后降趨勢，提取時間為60 min時對艾葉綠原酸的提取率相對最高，為8.89%，這說明超聲時間過少，會導致對綠原酸的提取不充分，而提取時間過長，則可能會導致水溫升高或部分酚酸類成分分解而影響對綠原酸的提取。因此，艾葉綠原酸提取的最佳時間以60 min為宜。

2.1.3 料液比對艾葉綠原酸提取率的影響 由圖3可知，隨料液比的下降，艾葉中綠原酸提取率呈先升后降趨勢，料液比為1 g ∶ 15 mL時對艾葉綠原酸的提取率相對最高，為9.25%。因此，艾葉綠原酸提取的料液比以1 g ∶ 15 mL為宜。

2.1.4 提取溫度對艾葉綠原酸提取率的影響 由圖4可知，隨提取溫度的升高，艾葉綠原酸提取率呈先升后降再升趨勢，其中以提取溫度為40 ℃時對艾葉綠原酸的提取率相對最高，為9.04%。因此，考慮到實際操作需要和節能減排，艾葉綠原酸的提取溫度以40 ℃為宜，響應面分析中也以此溫度作為提取溫度。

2.2 響應面法優化艾葉綠原酸提取工藝

由表2可見，提取條件為乙醇體積分數40%、料液比 1 g ∶ 15 mL、提取時間60 min時，艾葉中綠原酸提取率相對最高，為9.04%。試驗結果（表2、圖5）經回歸統計，得回歸方程為：Y=3.517 5+0.074X1+0.308 33X2+0.415 5X3-2.666 67×10-4X1X2+1.05×10-3X1X3+2.133 33×10-3X2X3-10-3X21-4.444 44×10-4X22-0.019 2×X23， 確定系數（R2）為0.904 7，說明艾葉綠原酸的試驗值與預測值間有較好的一致性。由表3可見，試驗因素中，一次項X1、二次項X21、X22、X23、交互項X2X3對回歸模型有極顯著影響（P<0.01），交互項X1X2、X1X3對回歸模型有顯著影響（P<0.05），這說明試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系;回歸模型F值為78.33，達極顯著水平;失擬度P值為 0.19，大于0.05，模型失擬度不顯著。通過降維及解析回歸模型，得到艾葉綠原酸最佳工藝條件為乙醇體積分數36.96%、料液比為1 g ∶ 15.16 mL、提取時間為59.98 min。考慮到實際操作需要，將艾葉綠原酸最佳提取條件工藝修正為乙醇體積分數37%、料液比為1 g ∶ 15 mL、提取時間為60 min，此條件下實際測得艾葉綠原酸提取率為10.89%，而回歸模型預測提取率理論值為12.75%，實際測定值比理論預測值低1.86百分點，說明該模型有較好的預測能力。

2.3 不同產地及不同年份艾葉樣品中綠原酸含量的測定

2.3.1 不同產地艾葉綠原酸含量差異 由表4可知，不同產地艾葉中綠原酸含量差異較大，河北保定的艾葉綠原酸含量相對最高，平均含量達到10.65%，稍高于湖北蘄春，顯著高于河南南陽、河南湯陰、浙江寧波等產區的艾葉（P<0.05）;河南湯陰的艾葉綠原酸含量居中，平均含量為10.22%，顯著高于浙江寧波、 河南南陽產區的艾葉;浙江寧波、河南南陽的艾葉綠原酸含量相對較低，其含量分別為8.69%、8.32%。

2.3.2 不同年份艾葉綠原酸含量差異 由表5可知，隨貯藏年份的延長，艾葉中綠原酸含量整體呈下降趨勢;2017年的河南湯陰艾葉綠原酸含量相對最高，平均含量為10.22%，顯著高于其他年份（P﹤0.05）;2016、2015年的艾葉綠原酸平均含量分別為8.37%、8.00%，相互間差異不顯著（P>0.05），顯著高于2013、2014年的艾葉;2013、2014年的艾葉綠原酸含量相對較低，分別為7.19%、6.97%。

3 結論與討論

隨著艾產業的快速持續發展，艾葉已成為中藥和食品領域的研究熱點，國內外學者多集中于化學成分、藥理作用及臨床療效等方面的研究，但對不同產地艾葉的有效成分含量是否存在差異、不同倉儲年限對艾葉品質是否有影響等問題卻少有研究。河南省張仲景方藥與免疫調節重點實驗室在前期研究的基礎上，利用響應面法優化艾葉綠原酸最佳提取工藝，并分析湖北蘄春、浙江寧波、河南湯陰、河北保定、河南南陽5個不同產地及河南湯陰2013—2017年5個不同年份艾葉綠原酸含量的差異，結果表明，艾葉綠原酸最佳提取工藝條件乙醇體積分數36.96%、料液比為1 g ∶ 15.16 mL、提取時間為 59.98 min，考慮到實際操作需要，將艾葉綠原酸最佳提取工藝條件修正為乙醇體積分數37%、料液比為1 g ∶ 15 mL、提取時間為60 min;不同產地艾葉中綠原酸含量差異較大，其中河北保定的艾葉綠原酸含量相對最高，達到10.65%，稍高于湖北蘄春，顯著高于河南南陽、河南湯陰、浙江寧波等產區的艾葉（P<0.05），河南湯陰的艾葉綠原酸含量居中，為10.22%，顯著高于浙江寧波、河南南陽產區的艾葉;不同年份艾葉中的綠原酸含量差異也較大，2017年河南湯陰的艾葉綠原酸含量相對最高，為10.22%，顯著高于其他年份，2013、2014年的艾葉綠原酸含量相對較低，分別為7.19%、6.97%，顯著低于其他年份的。

不同產地及不同年份的艾葉綠原酸成分含量存在明顯差異，這就要求在制劑生產和臨床應用中須區別對待，以確保其安全與有效;隨貯藏時間的延長，艾葉中的綠原酸含量整體呈逐漸降低的趨勢，與傳統認為的“陳艾質量較好”存在一定出入，這可能是由于陳艾主要用于艾灸，其質量評價體系主要考慮燃燒熱值，而在臨床應用中未考慮到艾葉中有效成分的變化，這須更為深入地探討研究。

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