甲基硫菌靈降解菌的篩選與鑒定

馬俊紅 周厚發 雷麗萍

摘要：為篩選出具有降解甲基硫菌靈能力的菌株，并對甲基硫菌靈的降解效果進行評價，采集云南各地植煙土壤樣品，在以甲基硫菌靈為單一碳源的選擇性培養基中富集微生物，用梯度稀釋法分離出451株農藥降解菌株。通過搖瓶培養和高效液相色譜法從451株菌株中篩選得到降解效率在80%以上的20株菌株。繼續對菌株的甲基硫菌靈降解能力進行溫室和田間篩選，結果表明，田間煙草施用甲基硫菌靈降解菌7 d后，參試的20株細菌均有降解甲基硫菌靈的效果，降低幅度為14.45%～91.84%。其中TP247、TP185、TP243、TP208、TP416等5株菌降解效果較好，分別為 91.84%、90.34%、89.54%、87.33%、85.50%，具有大面積應用推廣潛力。

關鍵詞：甲基硫菌靈;降解菌;高效液相色譜法;降解率

中圖分類號： S481+.8;X592 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0298-05

甲基硫菌靈別稱甲基托布津，是一種具有內吸性強、高效低毒、安全廣譜等優點的強力殺菌劑，是在煙草上登記使用的農藥之一，主要用于煙草白粉病、根黑腐病等的防治[1]。目前，化學防治是煙草病蟲害防治的主要措施之一，廣泛大量和長期使用化學農藥造成了煙葉中農藥殘留量的增加。煙草雖然不被直接食用，但其在燃燒過程中會發生大量復雜的化學反應，殘留農藥會直接或間接參與其中[1-2]，因此，農藥殘留問題已經引起煙草界和全社會的廣泛關注。

目前國內外農藥殘留降解方法主要有超聲波技術、吸附、洗滌和電離輻射等物理方法，水解、氧化分解和光化學降解等化學方法，微生物、降解酶和工程菌等生物降解方法[3]。微生物降解被公認為是一種有效、廉價、無二次污染的方法，具有操作簡便、繁殖快、生態恢復性好等優點[4-5]。早在20世界80年代密歇根州立大學的James Tiedje實驗室，就首次從污染的河泥中分離出了具有脫氯功能的厭氧微生物[6-7]。迄今為止，各國科研人員已經從土壤、污泥、污水、天然水體、垃圾場和廄肥中分離到降解多種農藥的活性微生物[8]。甲基硫菌靈是在煙葉農殘中檢出率較高的農藥之一，控制該農藥殘留量意義重大。本研究對甲基硫菌靈農藥降解菌進行分離、篩選、初步鑒定以及溫室和田間篩選，為煙葉和植煙土壤中甲基硫菌靈農藥污染的治理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土壤樣品 試驗于2014年1月至2016年12月在云南省煙草農業科學研究院研和試驗基地進行。本試驗用土壤采集自云南省昆明市、曲靖市、玉溪市、昭通市、麗江市、普洱市、保山市、臨滄市、楚雄州、紅河州、迪慶州、文山州、西雙版納州、大理州、德宏州、怒江州等16州（市）植煙土壤，共500份。

1.1.2 培養基 M9培養基配制：分別稱取3 g Na2HPO4、1.5 g KH2PO4、0.5 g NH4Cl，加500 mL蒸餾水，用NaOH調節pH值至7.4，配制固體平板時加入7～8 g/L瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌，待溫度冷卻至50～60 ℃時分別加入0.5 mL 1 mol/L 的CaCl2和MgSO4·7H2O，終濃度為0.1%的甲基硫菌靈;LB液體培養基：5 g酵母粉，10 g蛋白胨，10 g NaCl，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值=7.0，固體培養基加瓊脂2%，121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min。

1.1.3 供試煙草 供試煙草品種為云煙87，旺長期的煙株用于溫室和田間甲基硫菌靈降解菌的篩選。

1.1.4 供試農藥 70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，1 000倍液噴霧。

1.2 試驗方法

1.2.1 甲基硫菌靈降解菌分離和純化 量取45 mL純凈水盛于三角瓶內，在121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。稱取5 g土樣放入滅菌的三角瓶內，置于30 ℃、150 r/min搖床搖培 30 min，靜置10 min，取200 L上清液涂布于M9平板，置于 37 ℃ 恒溫培養箱培養7 d，挑選單菌落劃線于LB平板，純化后獲得單菌落，液體搖培并用20%甘油重懸浮，置于-80 ℃條件下保藏。

1.2.2 甲基硫菌靈降解菌的篩選 稱取6 g甲基硫菌靈粉劑溶于1 000 mL丙酮，配制成0.6%甲基硫菌靈母液。取已滅菌好的LB液體培養基5 mL于試管內，接種甲基硫菌靈降解菌于三角瓶中培養1 d后，加入1 mL甲基硫菌靈母液，置于30 ℃、150 r/min搖床培養3 d后檢測菌液中甲基硫菌靈含量，評價各菌株的降解效果。

1.2.3 甲基硫菌靈含量測定 樣品處理：培養菌液 5 000 r/min 離心10 min去除沉淀，用0.45 m濾膜過濾上清液，取10 L樣品經高效液相色譜儀分析;測定色譜分析條件：試驗采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，柱溫為30.0 ℃，檢測波長為266 nm，參比波長為400 nm，流動相的A相為CH3OH、B相為H2O、C相為CH3CN，流速 1 mL/min，每次進樣量10.0 μL，洗脫程序見表1。

1.2.4 甲基硫菌靈降解菌株的鑒定 將降解甲基硫菌靈效果較好的37株菌，PCR擴增16S rDNA片段。PCR產物純化后進行序列測定。將所得序列與EzBilCloud數據庫（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify）中標準菌株序列進行BLASTn分析，比較序列同源性。

1.2.5 甲基硫菌靈降解菌溫室篩選 使用室內篩選出的甲基硫菌靈降解菌，分別用100 mL LB培養基30 ℃搖培3 d，離心去除培養基，沉淀用無菌水懸浮，調整到菌體含量為 108 CFU/mL 備用。

農藥噴施1 d后，噴施不同菌懸液，每株菌處理3株煙，設不施菌的處理為對照（3株）。分別于降解菌處理14 d后取煙葉樣品，每次每煙株取3張葉，相同處理的煙葉樣品計數1份樣品，取樣時所取煙葉部位相同。樣品采集后，將其置于烘箱內105 ℃殺青30 min，60 ℃條件下烘干，去中脈，粉碎過20目篩，檢測甲基硫菌靈含量。

1.2.6 甲基硫菌靈降解菌田間篩選 使用溫室內篩選的甲基硫菌靈降解菌進行田間篩選，降解菌處理14 d后取煙葉樣品測試農藥殘留量，田間管理、樣品采集和檢測方法同 “1.2.5” 節。

2 結果與分析

2.1 甲基硫菌靈降解菌分離

以甲基硫菌靈為唯一碳源的培養基，采用稀釋平板法分離500份土樣，分離到451株菌株。分離結果表明，土壤樣品中能降解甲基硫菌靈的可培養微生物較少，43.6%的土樣僅能分離到1株菌株，有36.4%的樣品不能分離到降解菌，能分離2株以上菌株的土樣僅占總土樣的20%。土壤樣品最多僅能分離到4株降解甲基硫菌靈的菌株，占總土樣的1.6%，僅有8份土樣。通過對500個土樣進行分離試驗，以甲基硫菌靈為唯一碳源，只能生長出1個菌的土樣所占數量最多，其次1個菌都不能長的土樣所占的比例也比較大。

2.2 甲基硫菌靈降解菌液體培養篩選

甲基硫菌靈降解菌液體培養篩選結果表明，菌株降解率差異較大，對甲基硫菌靈降解率在80%以上的菌株共有20株，分別為TP157、TP350、TP206、TP382、TP427、TP381、TP389、TP439、TP329、TP441、TP415、TP416、TP426、TP402、TP208、TP163、TP254a、TP185、TP247、TP420（表2），可以用于后續試驗，具有進一步研究和應用的價值。

在以甲基硫菌靈為唯一碳源下能夠生長的451株菌中，其中413株菌的降解率在50%以下，所占比例高達91.6%;降解率在50%～90%之間的菌有30株，所占比例為6.7%;降解率在85%以上的菌有14株，所占比例僅為3.1%，其中有3株菌（TP157、TP206、TP350）的降解率在98%以上，降解能力極強。

2.3 甲基硫菌靈降解菌菌株的鑒定

通過16S rDNA序列聚類（圖1），可將37株甲基硫菌靈降解菌在0.1水平差異上分為5個類群，大多數菌集中在第1個類群中，含有24株細菌。TP228與其他菌株差異較大。運用EZbiocloud數據庫，將所測菌株的16S rDNA序列與標準株序列進行比對。分析表明，所測的37株菌歸屬于3門、4綱和5目（表3），總體上看，分離的菌株涉及11個屬、21個種細菌。有1株菌屬于放線菌門纖維菌屬，23株菌屬于壁厚菌門芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬下11種，13株菌屬于變形菌門蒼白桿菌屬和耐寒短桿菌等9個屬（表3）。綜上所述，芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬和蒼白桿菌屬占測試菌株的比例較大，為優勢菌。

通過16S rDNA序列分析，室內篩選中獲得的甲基硫菌靈降解率在98%以上的菌株有TP157、TP206、TP350，其中TP157屬于假單胞菌屬，TP206和TP350都屬于蒼白桿菌屬，三者都屬于變形菌門。

2.4 甲基硫菌靈降解菌的溫室篩選

噴施室內篩選的20株高效降解甲基硫菌靈菌株14 d后，未處理的對照中可檢測出大量的甲基硫菌靈殘留，而經降解菌株處理后，除TP106處理的煙葉中農藥殘留量與對照無明顯差異，TP179煙葉中農藥殘留量高于對照外，其他18株菌處理的樣品中的農藥殘留量均有不同程度的降低，降解率范圍在 6.29%～52.40%，其中TP185、TP382、TP208、TP389、TP420和TP243等6株菌溫室降解甲基硫菌靈的降解率在40%以上，TP185和TP382降解菌甲基硫菌靈降解率在50%以上。

2.5 甲基硫菌靈降解菌田間篩選試驗

試驗表明，田間煙草施用甲基硫菌靈降解菌14 d后，參試的20株細菌均有降解農藥的效果，降低幅度為14.45%～91.84%。TP179、TP350、TP106、TP382、TP405、TP381、TP254、TP242、TP206、TP163、TP416、TP208、TP243、TP185、TP247等15株細菌的田間降解率大于50%，其中TP247、TP185、TP243、TP208、TP416等5株菌降解效果較好，降解率分別為91.84%、90.34%、89.54%、87.33%、85.50%，具有大面積應用推廣潛力，須研究其生物安全性和應用前景（表5）。

3 結論與討論

甲基硫菌靈是一種廣譜性內吸低毒殺菌劑，具有內吸、預防和治療作用，在煙草生產中常用于真菌類病害的防治。由于其具有內吸性，并在煙株體內轉化成多菌靈[9]，因此更容易形成殘留。本研究中未測定煙葉中多菌靈的含量，無論對空白對照還是試驗處理均只測定煙葉上甲基硫菌靈的殘留量，具有可比性，可將篩選出的菌株應用于減少土壤中甲基硫菌靈的殘留。此外，本研究采集的云南省各州（市）煙區噴灑過甲基硫菌靈的土壤中所含降解甲基硫菌靈的菌株較少，這可能是由于甲基硫菌靈降解速度緩慢，易于富集，在煙葉和土壤中殘留量較大，研發有效的甲基硫菌靈降解微生物制劑用于減少該農藥殘留具有廣闊的應用前景。

土壤中的微生物具有種類多、變異快、適應強等特點，是生物修復的重要資源。細菌由于具有適應能力強、易誘變的特點，在農藥降解中占據著重要的地位。目前，已分離出來的能降解農藥的細菌主要有假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、黃桿菌屬、產堿菌屬、節細菌屬等[10-13]，本研究通過田間篩選出的降解率高于85%的菌株有TP247、TP185、TP243、TP208和TP416，分別屬于克雷伯菌屬、短小桿菌屬、蒼白桿菌屬、固氮螺菌屬和芽孢桿菌，除芽孢桿菌屬和蒼白桿菌屬之外[14]，其他3個屬鮮有報道。

在液態培養環境下，TP157、TP350和TP206菌株降解甲基硫菌靈的能力較強，降解效率均在98%以上，在溫室條件下，其降解率均降低至35%以下，在田間條件下，其降解率分別為14.45%、55.84%、78.61%。說明降解菌生長繁殖和對靶標農藥的降解受到環境因素（如溫度、濕度、光照等）的影響較大。深入研究農藥降解菌菌株的降解特性、研發適合菌株施用的劑型，將極大地提升菌株降解農藥殘留的能力。如何將篩選出的高效甲基硫菌靈降解菌應用于實際生產有待于進一步研究。

在自然界中存在著豐富的能夠降解甲基硫菌靈的微生物。用梯度稀釋法分離篩選出451株農藥降解菌株。通過搖瓶培養和高效液相色譜法復篩得到降解效率在80%以上的20株菌株。然后通過田間試驗發現，參試的20株細菌均有降解甲基硫菌靈的效果，降低幅度為14.45%～91.84%。其中TP247、TP185、TP243、TP208、TP416等5株菌降解效果較好，降解率分別為91.84%、90.34%、89.54%、87.33%、85.50%，可作為甲基硫菌靈降解菌生物制劑的備選菌株。

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