共信號分子CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4在系統性紅斑狼瘡患者外周血中的表達水平及意義

白冷媚，謝傳美

(川北醫學院附屬醫院風濕科，四川 南充 637000)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以多系統損害為主要臨床表現，以多種特異性自身抗體陽性為主要實驗室特征的慢性自身免疫性疾病。目前研究顯示其病因及發病機制可能與環境因素、基因、固有免疫和獲得性免疫、特定的器官損害有關[1]。

隨著研究深入，發現許多細胞因子(IL-6、IL-17等)參與免疫性疾病的發生發展，且已在風濕病中進行了臨床試驗[2]。近年來又發現一些新的抗原如CD28、可誘導共信號分子(inducible co-stimulator，ICOS)、程序性壞死分子1(programmed death-1，PD-1)和細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4/CD152)這樣的共信號分子，它們在SLE等多領域的疾病中均異常表達，通過阻斷上述共信號分子通路作為免疫系統疾病的靶點治療，或可成為一種新型的治療方案。CD28和ICOS是正性共信號分子[3](共刺激分子)，主要參與激活T細胞；PD-1及CTLA-4作為負性共信號分子[4](共抑制分子)，主要抑制淋巴細胞活化，它們的共同作用維持著體內免疫應答及免疫耐受的平衡。查閱國內外文獻發現，部分上述共信號分子在SLE患者外周血中的表達水平尚有爭議。

基于目前國內外的文獻資料，涉及同一患者活躍期與非活躍期自身對照的研究還很少，故擬采用FCM檢測CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4在SLE患者活躍期外周血中CD4+T細胞上的表達水平，并與自身對照組及健康對照組比較，探討上述共信號分子是否與疾病活動度有關，以此初步推測在上述4種共信號分子中哪1種或哪幾種共信號分子占主導地位。

1 材料與方法

1.1 研究方法

本研究采用病例對照研究，應用免疫熒光標記和流式細胞術檢測20例SLE活躍期患者及30名健康體檢者外周血CD4+T細胞表面上CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4的表達水平，并以上述狼瘡患者非活躍期作為自身對照，同時統計所有受試者的基本資料、各項臨床數據及實驗室檢查結果，分析各實驗室數據之間的差異是否有統計學意義，以及共信號分子與疾病活動度的相關性。

1.2 研究對象

收集2015年6月至2017年11月川北醫學院附屬醫院風濕血液科住院及門診20例SLE患者。

應用免疫熒光標記和流式細胞術檢測各受試者外周血CD4+T細胞上4種共信號分子的表達水平。其中女性18例，男性2例，年齡10～57歲，平均(38.50±13.10)歲，病程0～20年，平均(3.9±4.52)年(其中15例為初診患者)，活躍期SLE患者SLEDAI評分均≥10分平均(15.3±4.18)分。非活躍期患者SLEDAI評分均≤6分平均(3.9±1.33)分；健康對照組為30名女性健康體檢者，年齡24～63歲，平均(35.67±11.82)歲。各組間性別、年齡無顯著性差異。所有患者均符合美國風濕病學會(ACR)1997年修訂的SLE診斷標準[5]，排除合并以下疾病的患者：(1)感染；(2)惡性腫瘤、慢性腎炎、甲狀腺疾病等；(3)重疊綜合征。同時記錄所有SLE患者的一般資料，包括癥狀、體征、實驗室檢查結果、影像學檢查結果等。

1.3 實驗方法

1.3.1 外周血的采集和保存 所有受試者均清晨空腹采集外周血標本1 mL，室溫下EDTA抗凝，及時(6 h內)行流式細胞術檢測。

1.3.2 流式細胞術檢測 流式細胞術檢測外周血CD4+T細胞上CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4的表達水平。

1.4 統計學分析

2 結果

結果顯示，在活躍期組、非活躍期組及健康對照組外周血CD4+T淋巴細胞上，4種共信號分子(CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4)均表達。

2.1 CD28

活躍期組外周血CD4+T細胞上CD28的表達為(46.53±14.55)%，與健康對照組[(40.78±14.51)%]比較差異無統計學意義(P=0.176，P>0.05)，與自身對照組[(31.39±16.29)%]比較，差異有統計學意義(P=0.045，P<0.05)，活躍期組高表達。見圖1。

2.2 ICOS

活躍期組與健康組、自身對照組ICOS的表達分別為(1.9±0.98)%、(1.76±1.18)%、(1.749±0.67)%，差異均無統計學意義(P=0.6839，P>0.05；P=0.5863，P>0.05)。見圖2。

2.3 PD-1

活躍期組PD-1的表達為(10.88±4.09)%，較健康組(4.65±3.08)%顯著升高(P<0.001)，與自身對照組(6.67±4.00)%比較也有顯著差異(P=0.002)。見圖3。

2.4 CTLA-4

活躍期組(0.16±0.13)%與健康組(0.67±0.83)%比較差異有顯著統計學意義(P=0.008，P<0.01)；非活躍期組(0.17±0.13)%與健康組比較差異有統計學意義(P=0.01，P<0.05)；但20例自身對照組差異無統計學意義(P=0.724，P>0.05)。見圖4。

經過統計學分析發現，CD28、ICOS的表達與SLEDAI呈正相關性，PD-1、CTLA-4的表達與SLEDAI呈負相關性，但4種共信號分子與SLEDAI均無明顯相關性(表1，圖5-圖6)。

表1外周血CD4+T細胞上4種共信號分子表達水平與SLEDAI的相關性

組別r值(Spearman)CD28 vs SLEDAI0.110 609ICOS vs SLEDAI0.047 729PD-1 vs SLEDAI-0.280 311 CTLA-4 vs SLEDAI-0.050 058

上述4種共信號分子與SLEDAI的|r|均<0.3。

3 討論

人體獲得性免疫應答和造血動態平衡的維持需要T淋巴細胞增殖的精確調節，要完全激活靜止的T細胞需要CD28、ICOS這樣的受體，而抑制淋巴細胞活化則需要PD-1和CTLA-4這樣的受體轉導信號。這種正/負信號的平衡能夠在維持機體免疫耐受的同時保證有效的免疫應答以及防止自身免疫[4]。

CD28通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，影響細胞因子的合成和存活[4]，同時促進T 細胞活化、IL-2生產和 T 細胞的存活[6]。

在本實驗中，僅自身對照組之間差異有統計學意義(活躍期組高表達)。既往有研究顯示CD28在患者血清中高表達，但與SLEDAI評分無相關性[7-8]。而1996年的一項研究指出狼瘡患者CD28+T細胞選擇性降低，且是由于CD28-介導的協同信號影響了T細胞對激活誘導細胞死亡(activation-induced cell death，AICD)的易感性[9]。本實驗統計學顯示自身對照組之間差異有統計學意義，但由于樣本量較少，上述結果是否有意義尚不明確。現有文獻中，Bijl等[10]的一項類似研究與本實驗結果相近，除結果外，該研究與本實驗相似處還在于樣本量也較少，故在后續的實驗中可通過進一步擴大樣本量來證實CD28是否異常表達。

同樣作為共信號分子的ICOS有24%氨基酸序列與CD28同源， CD28可增強ICOS的表達，當缺乏CD28的配體B7-1和B7-2時其表達的上調則顯著降低，故據此推測ICOS可能為活化后的T細胞提供共刺激信號[6]。雖然ICOS的表達水平是否存在差異仍有爭議，但有文獻顯示ICOS在SLE患者中高表達[10-13]。

本實驗結果顯示ICOS的表達差異無統計學意義，與CD28的檢測結果一致。查閱國內外文獻發現，二者的表達有一致性，由于本實驗是使用同一樣本同時檢測4種共信號分子，那么上述檢測結果是否可以用ICOS與CD28的一致性來解釋，或仍然是由于樣本量少而使得陽性結果尚不能被檢測出來？要證實上述猜測仍需要進一步收集樣本量來解決。

PD-1亦屬于免疫球蛋白超家族，它通過阻止CD28介導的磷脂酰肌醇3-激酶活化來抑制蛋白激酶磷酸化，從而對T細胞活化起負性調節作用。SLE以T細胞的異常活化為特征，機體為維持免疫平衡增加PD-1的表達，從而達到負性調節的作用。同時也有研究證實缺失PD-1的小鼠更容易患自身免疫性疾病[4，14-18]。

本實驗結果顯示PD-1在SLE患者中較健康對照組顯著高表達，且活躍期組較對照組仍高表達，這一結果與既往文獻相符[17]。

CTLA-4的作用機制尚未研究清楚，但多項研究已經證實其主要功能是下調T細胞反應。早年Liu等[19-20]的研究發現與健康對照組相比，SLE患者CTLA-4陽性T細胞的百分比顯著增加。但其后的一項研究顯示在誘導后SLE患者表達的T細胞中，CTLA-4的表達較健康對照組低。隨后Lee等[21]發現在活躍期SLE患者中，CD4+CD25+Treg細胞的百分比較非活躍期SLE患者及健康對照組顯著降低，同時發現在活躍期SLE患者外周血PBMCs中，CD4+T細胞上CTLA-4的表達較非活躍期及健康組升高，由于CD4+T細胞上CTLA-4的優先表達主要受限于Treg細胞，由此推測CTLA-4的表達可能與活躍期SLE患者免疫防控功能所致的Treg細胞介導的抑制功能活化相關。

本實驗結果顯示活躍組組CTLA-4較健康組低表達，而自身對照組差異無統計學意義。曾有文獻報道在小鼠的一項實驗中，刺激后的CTLA-4相較于細胞表面，更多的是在細胞質表達[22]，同時也有研究推測其低表達可能是由于CTLA-4為瞬時表達并快速的進入細胞質[23-24]，那么通過流式細胞術檢測細胞表面的CTLA-4的表達便尤為困難，或許這可以解釋為何在SLE患者外周血CD4+T細胞表面上CTLA-4的表達是降低的，同時也不排除其低表達是否與SLE患者CTLA-4分子下調功能的受損或與“T細胞耗竭”有關。要證實上述觀點仍需要進一步的實驗或其他實驗室檢測方法。