川芎嗪對肺癌順鉑耐藥細胞A549/DDP凋亡的影響

來岳標 姚慶華

順鉑是肺癌化療的基礎藥物，但是其有效率往往隨著腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生而逐步降低，甚至無效，腫瘤細胞對順鉑的耐藥嚴重影響了化療療效[1]。川芎嗪（tetramethypyrazine，TMP）是中藥川芎的有效成分，具有抗血小板聚集、改善血流動力學、增強免疫力、清除氧自由基及改善纖維化等作用。已有研究證實，川芎嗪具有抗腫瘤生長、抗血管生成、抗細胞耐藥、放療增敏、抑制腫瘤細胞遠處侵襲轉(zhuǎn)移等作用，但對于川芎嗪逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對化療藥物耐藥性的研究尚處于起步階段[2-3]。研究表明，川芎嗪能在細胞層面誘導多種腫瘤細胞的凋亡，但其對川芎嗪誘導凋亡的分子機制研究仍不夠深入[4]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路對基因的表達及細胞質(zhì)功能的正常發(fā)揮起著關鍵的作用，并廣泛參與細胞凋亡，其信號通路的二級結(jié)構(gòu)主要由應激活化蛋白激酶（JNK）、p38蛋白激酶、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）三個部分相互交叉連接組成[5]。本研究從分子水平探討川芎嗪誘導順鉑耐藥細胞株A549/DDP的凋亡機制。

1 實驗材料

1.1 細胞培養(yǎng) 實驗所用耐藥細胞株A549/DDP由浙江省腫瘤醫(yī)院實驗室提供。肺腺癌A549/DDP細胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃且含5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，1:4～1:5比率傳代。

1.2 藥 物 川芎嗪（四甲基吡嗪）注射液：規(guī)格80mg/支，批號20150552，由北京四環(huán)科寶制藥有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑及儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基（批號 30030）、胎牛血清（批號 11012）、緩沖液（批號 C0221A）、消化液（批號 C0201）、培養(yǎng)皿（批號 FCD101）等購于碧云天生物有限公司。顯微鏡（XSP-2C）、流式細胞儀（FACSCanto）、放射自顯影儀（DC-400SL）等儀器由浙江省腫瘤醫(yī)院實驗室提供。

2 方法

2.1 MTT法測定不同濃度川芎嗪對A549/DDP細胞增殖抑制率的影響 細胞傳代3次后收集A549/DDP細胞，洗滌沉淀后用培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至7×104個/mL，用移液器將細胞懸液加至96孔板，每孔200μL。12h后顯微鏡下仔細觀察并確認細胞貼壁后用培養(yǎng)基調(diào)整川芎嗪濃度（0.10、0.20、0.40、0.80、1.00mg/mL），將不同濃度TMP分別加入96孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)孵育，空白對照組加入RPMI-1640培養(yǎng)基。在加入藥物24h、48h、72h后分別加入20μL噻唑藍（MTT）溶液終止細胞增殖，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育A549/DDP細胞4h后用移液器小心吸棄96孔板內(nèi)的液體；二甲基亞砜150μL均勻加入96孔板后將其置于振蕩器上緩慢勻速振蕩10min。振蕩結(jié)束后將96孔板置于酶標儀中及時測定每孔吸光值，將吸光值轉(zhuǎn)換為A549/DDP細胞增殖抑制率。然后根據(jù)不同濃度川芎嗪所對應的A549/DDP細胞增殖抑制率繪制曲線圖。每一濃度均設置6個平行對照孔，實驗3次以上。

2.2 流式細胞法測定川芎嗪對肺腺癌A549/DDP細胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期的A549/DDP細胞每孔10×105個/mL接種于培養(yǎng)皿中，24h后實驗組加入濃度為 0.20mg·mL-1、0.40mg·mL-1、0.80mg·mL-1的川芎嗪，對照組不加藥物。不同濃度川芎嗪加入后繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育72h后離心、洗滌、收集A549/DDP細胞。用培養(yǎng)基調(diào)整濃度為2×106/mL。各組取1mL細胞懸液后，在4℃、800rmp條件下離心12min，移棄上清液。PBS液提前預冷至4℃，將A549/DDP細胞洗滌3次后用培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整至2×106個/mL。將細胞懸液移至流式管后加入細胞結(jié)合緩沖液，細胞懸液與細胞結(jié)合緩沖液充分接觸后再加入細胞染色液后，將流式管放置于0℃避光條件下繼續(xù)孵育15min。孵育結(jié)束后將流式管置于流式細胞儀內(nèi)進行細胞凋亡相關數(shù)據(jù)采集并分析結(jié)果。

2.3 川芎嗪對肺腺癌A549/DDP細胞形態(tài)的影響取A549/DDP細胞每孔1×105個/mL接種于六孔板中，12h后確認細胞貼壁，實驗組A549/DDP細胞用濃度為0.40mg/mL的川芎嗪處理72h進行干預，對照組加入等量培養(yǎng)基。72h后離心、洗滌、收集細胞后加入2.5%的戊二醛溶液中在4℃避光條件下固定4h，固定結(jié)束后用乙醇溶液進行細胞脫水處理，分別予丙酮及環(huán)氧樹脂處理并包埋2h，將包埋后的標本放置于62℃烤箱中烘烤后結(jié)束后進行標本超薄切片處理；運用透射電子顯微鏡仔細觀察細胞處理前后是否有形態(tài)學及凋亡征象的變化。通過觀察細胞胞體大小、細胞質(zhì)濃縮狀態(tài)、細胞核染色質(zhì)凝聚情況、細胞核膜、細胞質(zhì)膜以及細胞器完整與否來判斷耐藥細胞A549/DDP的凋亡。每一濃度均設置6個平行對照孔，實驗3次以上。

2.4 免疫印跡實驗 取對數(shù)生長期的A549/DDP細胞，每孔20×105個/mL接種于培養(yǎng)皿中，不同濃度川芎嗪（0.2mg·mL-1、0.4mg·mL-1）處理 A549/DDP 細胞72h后離心、洗滌、收集細胞，用預冷的PBS液懸浮細胞后洗滌2遍，將洗滌干凈后的細胞加入提前預冷的細胞裂解液中充分接觸，對照組不加藥物。對照組及不同濃度藥物處理組均采用BCA進行蛋白濃度測定，并記錄數(shù)據(jù)。采用10%凝膠跑電泳后分離、轉(zhuǎn)膜。用TBST液體在常溫下進行抗體封閉。洗膜后于4℃條件下孵育相對應的一抗（P-JNK，JNK，PP38，P38，P-ERK，ERK）12h，一抗稀釋濃度均為 1：1000。12h后室溫下漂洗3次后孵育二抗，化學發(fā)光顯色劑涂勻后，于自顯影儀中曝光并收集數(shù)據(jù)。

2.5 統(tǒng)計學方法 本實驗均在相同實驗條件下進行3次及以上實驗。應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 川芎嗪抑制肺癌細胞A549/DDP的增殖 川芎嗪對A549/DDP細胞的增殖抑制率隨著川芎嗪濃度的增加和作用時間的延長而逐漸增加，有時間和劑量依賴性（P＜0.05）。川芎嗪作用72h A549/DDP細胞在增殖抑制率上表現(xiàn)出明顯的梯度，故后續(xù)實驗均選用藥物干預72h作為實驗條件。見表1。

表1 不同濃度川芎嗪對肺癌A549/DDP細胞增殖抑制率的影響（%，）

表1 不同濃度川芎嗪對肺癌A549/DDP細胞增殖抑制率的影響（%，）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與 24h 組比較，△P＜0.05；與 48h 組比較，▲P＜0.05；TMP：川芎嗪

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3.2 川芎嗪誘導肺癌細胞A549/DDP的凋亡 川芎嗪（0.20mg·mL-1、0.40mg·mL-1、0.80mg·mL-1）處理耐藥細胞A549/DDP 72h后，細胞早期凋亡（AV+/PI-）比例隨著川芎嗪濃度的增加而逐漸增加，并且存在濃度依賴性，見插頁圖1。

表2 MAPK信號通路蛋白表達灰度值比較（

表2 MAPK信號通路蛋白表達灰度值比較（

注：與對照組比較，*P＜0.05；與 TMP（0.20mg/mL）比較，△P＜0.05；TMP：川芎嗪；P-ERK：磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；ERK：細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；P-JNK：磷酸化應激活化蛋白激酶；JNK：應激活化蛋白激酶；p38：蛋白激酶；P-p38：磷酸化p38蛋白激酶；Action：內(nèi)參蛋白

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3.3 川芎嗪作用前后A549/DDP細胞形態(tài)變化 川芎嗪處理后A549/DDP細胞出現(xiàn)了典型的凋亡形態(tài)改變：細胞核凝聚，呈新月形；細胞體積縮小；細胞膜、質(zhì)膜及細胞器不連續(xù)、完整性消失；胞質(zhì)內(nèi)可見數(shù)量不等、大小不一的空泡出現(xiàn)；典型的凋亡小體出現(xiàn)，見插頁圖2。

3.4 川芎嗪通過MAPK信號通路誘導A549/DDP細胞的凋亡 P-JNK及P-P38在川芎嗪處理后出現(xiàn)蛋白量表達量增加的趨勢，而P-ERK出現(xiàn)表達降低的趨勢；而非磷酸化表達的ERK、JNK、P38在蛋白水平無明顯變化。通過Western blot檢測表明，在MAPK信號通路中川芎嗪能通過抑制ERK的表達的同時增加JNK和P-38在蛋白水平的表達從而誘導耐藥細胞株A549/DDP細胞的凋亡，見表2、插頁圖3。

4 討論

細胞凋亡是生物體內(nèi)基因控制的一種細胞死亡過程，其主要目的是通過細胞凋亡后將細胞凋亡產(chǎn)物進行重新利用，維持體內(nèi)代謝的需要，是一種主動的損傷現(xiàn)象，是細胞為了適應環(huán)境的變化而主動死亡的一個過程，細胞凋亡對于腫瘤的產(chǎn)生及生長過程具有十分重要的意義[6-8]。

本研究顯示，川芎嗪與細胞增殖率之間存在時間劑量依賴性（P＜0.05），川芎嗪作用72小時后A549/DDP細胞在增殖抑制率上表現(xiàn)出明顯的梯度。V-PI染色法檢測顯示川芎嗪處理A519/DDP細胞后，早期凋亡率隨著川芎嗪濃度的增加而逐漸增加，說明川芎嗪誘導的細胞凋亡是殺傷A549/DDP細胞的途徑之一。電子顯微鏡觀察可見川芎嗪0.40mg·mL-1處理后A549/DDP細胞細胞核凝聚，細胞體積縮小，細胞膜、質(zhì)膜及細胞器不連續(xù)，完整性消失，胞質(zhì)內(nèi)可見數(shù)量不等、大小不一的空泡和典型的凋亡小體出現(xiàn)，直接證明了A549/DDP細胞的凋亡。

MAPK信號通路涉及多種生物學行為，具有將細胞表面的信息傳遞至核內(nèi)進而影響基因轉(zhuǎn)錄的重要傳遞途徑，對于腫瘤耐藥細胞凋亡的產(chǎn)生發(fā)揮著重要的作用，主要由ERK、JNK和p38組成；ERK參與細胞的增殖、分化和增殖活性，JNK和p38激酶主要由細胞外刺激產(chǎn)生應答[15]。本實驗表明，川芎嗪處理72小時后P-JNK及p-P38蛋白量表達增加且呈現(xiàn)出濃度依賴性，而p-ERK出現(xiàn)表達降低的趨勢（P＜0.05）；而非磷酸化表達的 ERK、JNK、P-38在蛋白水平未見到有意義的變化。

綜上所述，本研究觀察到川芎嗪能引起順鉑耐藥細胞株A549/DDP的增殖抑制及凋亡，表現(xiàn)出JNK及p-38在磷酸化水平的活化，說明川芎嗪能通過MAPK信號通路引起A549/DDP的凋亡。