配對盒4基因單核苷酸多態性與妊娠期糖尿病相關性研究

金 燕 詹 欣

作者單位：1杭州市富陽區第二人民醫院婦產科（杭州 311404）；2杭州市第一人民醫院婦產科（杭州 310006）

妊娠期糖尿?。℅DM）是妊娠期出現的葡萄糖耐受不良，與先兆子癇、胎兒圍產期死亡和2型糖尿病（T2DM）發生風險增加有關[1-2]。妊娠期外周胰島素抵抗增加的原因包括雌激素、人胎盤泌乳素和催乳素的產生增加[3]。研究顯示，肥胖、家族史、生活方式、種族特點、遺傳因素等均是GDM和T2DM的危險因素[4-6]。近年來遺傳因素與GDM的相關性逐漸成為研究的熱點，配對盒4（PAX4）基因在維持胰島素細胞表型和胰島β細胞的增殖和分化具有非常重要的作用[7]。本研究選擇PAX4基因的rs10229583位點和rs114202595位點的基因多態性進行分析，旨在探討PAX4基因的這兩個單核苷酸多態性（SNPs）對于GDM的發病風險的影響，為GDM的預防和治療提供依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年3月—2016年10月杭州市富陽區第二人民醫院收治的臨床資料完整的205例GDM患者作為研究組。納入標準：（1）年齡＞20歲；（2）診斷標準符合國際妊娠糖尿病研究協會關于 GDM 的診斷標準[8]；（3）漢族。排除標準：（1）妊娠前即患有糖尿病的患者；（2）慢性高血壓患者；（3）腎功能不全患者；（4）類風濕性關節炎患者；（5）系統性紅斑狼瘡患者。同期招募125名健康妊娠的婦女作為對照組。所有研究對象均簽署知情同意書，經本院醫學倫理委員會審核通過。

1.2 方 法 記錄所有研究對象年齡、孕周、體質量指數（BMI）、血糖水平（口服葡萄糖耐量試驗 0、1、2h）、血清糖化血紅蛋白（HbA1c）水平、甘油三酯濃度。所有研究對象在妊娠24～28周之間接受75g口服葡萄糖耐量試驗，均于禁食12h后在上午8:30-9:30之間進行檢查，采用日立生化分析儀7600型檢測血糖水平；采用乳膠增強免疫比濁法測定血清HbA1c水平；化學發光法檢測甘油三酯水平，檢測儀器為Olympus400全自動生化儀（日本）。BMI計算方法為體質量（kg）與身高平方（m2）的比值。

1.3 基因型檢測 從研究對象外周靜脈血中抽提基因組DNA（試劑盒為QIAamp DNA Blood Mini Kit（50），批號 51104，QIAGEN，德國）。抽提基因組 DNA后采用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增目的片段進行Sanger測序，rs10229583位點的PCR擴增引物序列為：5’-CAACAGTGCTGCCTATTCCC-3’（正向）；5’-TAGGAAAGGAGATGCCCTCA-3’（反向）。rs114202 595位點的PCR擴增引物序列為：5’-GTAGGTGGAGACAGATGGGAAA-3’（正向）；5’-GTAGTCCCTGGTCCTCCTGTAA-3’（反向）。PCR反應體系（終濃度） 為：10ng gDNA，1×PCR buffer，200mmol的正反向引物，2.0mmol/L MgCl2，無核酸酶水補足 20μL。PCR 反應條件為：95℃預變性 10min；95℃，20s；60℃，20s；72℃，20s；共 35 個循環；然后 72℃，10min；4℃，∞。PCR完成后將PCR擴增產物采用瓊脂糖凝膠電泳切膠純化 [試劑盒為QIAquick Gel Extraction Kit（50），批號 28704，QIAGEN，德國]后采用 Sanger測序檢測產物的序列，測序儀為ABI310型基因分析儀（美國），見圖1。

1.4 統計學方法 應用SPSS21.0軟件進行統計分析。連續變量用均值±標準差（s）表示，并用t檢驗。使用 Pearson's χ2檢驗和比值比（OR）分析 SNPs位點基因型和等位基因與GDM的相關性。使用χ2檢驗評估基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡。所有檢測均為雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 PAX4基因rs10229583和rs114202595位點SNPs基因型Sanger測序結果

2 結果

2.1 妊娠期糖尿病患者與健康妊娠婦女一般資料比較 研究組年齡 24～35歲，平均（30.54±4.35）歲，孕周（38.15±2.34）周，體質指數（BMI）（27.04±3.25）kg/m2。對照組年齡 25～36 歲，平均（29.84±4.26）歲，孕周（38.17±2.42）周，BMI（26.21±3.32）kg/m2，均為漢族，無糖尿病家族史和脂代謝異常史。研究組患者與對照組年齡、孕周等一般資料差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 妊娠期糖尿病患者與健康妊娠婦女BMI、血糖、血脂水平比較 研究組孕婦的BMI、0、1、2h血糖水平、血清HbA1c水平、甘油三酯濃度顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。

表1 妊娠期糖尿病患者與健康妊娠婦女BMI、血糖、血脂水平比較（mmol/L

表1 妊娠期糖尿病患者與健康妊娠婦女BMI、血糖、血脂水平比較（mmol/L

注：HbAlc：糖化血紅蛋白；BMI：體質指數

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2.3 妊娠期糖尿病患者與健康妊娠婦女PAX4基因SNPs位點基因型和等位基因頻率比較 所有研究對象PAX4基因rs10229583位點和rs114202595位點基因型均處于Hardy-Weinberg平衡狀態（P＞0.05），見表2。PAX4基因rs10229583位點研究組研究對象G等位基因頻率顯著高于對照組（83.41%vs77.20%），G等位基因是妊娠期糖尿病的危險因素（OR=1.485，95%CI=0.983～2.244，χ2=3.907，P=0.048）。PAX4基因rs114202595位點研究組研究對象A等位基因頻率顯著高于對照組（8.05%vs3.60%），A等位基因是妊娠期糖尿病的危險因素（OR=2.344，95%CI=1.054～5.368，χ2=5.158，P=0.023）。

2.4 PAX4基因SNPs位點基因型與妊娠期糖尿病患者臨床特征參數的相關性 結果顯示，妊娠期糖尿病患者rs10229583位點和rs114202595位點各基因型之間的年齡、孕周、BMI、血糖水平、HbAlc、甘油三酯水平等的差異無統計學意義（P＞0.05），即PAX4基因SNPs位點基因型與妊娠期糖尿病患者的年齡、孕周、BMI、血糖水平、HbAlc、甘油三酯水平等參數之間無相關性，見表3、4。

表2 妊娠期糖尿病患者與健康妊娠婦女PAX4基因SNPs位點基因型和等位基因頻率比較

表3 PAX4基因rs10229583位點SNP與GDM患者臨床特征參數的相關性（mmol/L

表3 PAX4基因rs10229583位點SNP與GDM患者臨床特征參數的相關性（mmol/L

注：BMI：體質指數；HbAlc：糖化血紅蛋白；PAX4：配對盒 4；SNP：單核苷酸多態性；GDM：妊娠期糖尿病

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表4 PAX4基因rs114202595位點SNP與GDM患者臨床生化特征的相關性（mmol/L

表4 PAX4基因rs114202595位點SNP與GDM患者臨床生化特征的相關性（mmol/L

注：BMI：體質指數；HbAlc：糖化血紅蛋白；PAX4：配對盒 4；SNP：單核苷酸多態性；GDM：妊娠期糖尿病

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3 討論

GDM是由遺傳、環境、免疫等多種因素引起的疾病，且GDM與T2DM具有相似的遺傳背景。因此與T2DM相關的SNPs位點也成為了篩選與GDM相關性的靶點[9-10]。有研究顯示，與T2DM相關的遺傳性變異也與GDM有關[11]。胰島特異性轉錄因子——PAX4基因編碼一種轉錄因子，能夠促進胚胎組織細胞的增殖、分化和存活[12]。為了研究PAX4基因單核苷酸多態性是否與GDM的發生具有相關性，本研究評估了PAX4基因的rs10229583位點和rs114202595位點SNPs與GDM的相關性。

本研究結果顯示，GDM患者的BMI、血糖水平、HbA1c和甘油三酯濃度均顯著高于正常對照組（P＜0.05），臨床診斷GDM的孕婦需要接受飲食和運動治療，必要情況下可以采用藥物治療以控制血糖水平。分析GDM患者組和正常妊娠組GDM基因的rs10229583位點和rs114202595位點基因型和等位基因頻率結果發現，GDM患者的rs10229583位點G等位基因頻率顯著高于正常妊娠的孕婦，提示G等位基因是GDM的危險因素（OR=1.485，95%CI=0.983 ～2.244，χ2=3.907，P=0.048）。GDM 患 者 組rs114202595位點A等位基因頻率顯著高于對照組，說明A等位基因是GDM的危險因素（OR=2.344，95%CI=1.054～5.368，χ2=5.158，P=0.023）。有研究發現，rs10229583與T2DM的發生相關[13]。Ma等[14]研究顯示，PAX4基因rs10229583位點SNPs與空腹血糖升高和β細胞功能的下降有關。另外，鄧德耀等[15]研究顯示，PAX4基因的rs114202595位點SNPs與云南省昆明地區T2DM患者胰島β細胞功能進展性紊亂有關。PAX4是β細胞的關鍵調控者之一，缺乏PAX4的小鼠在產后幾天死亡，它們由于缺乏成熟的胰島β細胞而發展成嚴重的高血糖癥[16]，PAX4基因rs10229583位點和rs114202595位點單核苷酸多態性可能影響PAX4的表達，進一步導致胰島β細胞功能缺失，具體還需要進一步研究證實。

與此同時，本研究還分析了PAX4基因的rs10229583位點和rs114202595位點SNPs對患者臨床癥狀參數的影響，結果顯示，PAX4基因SNPs位點基因型與GDM患者的年齡、孕周、BMI、血糖水平、HbAlc、甘油三酯水平等參數之間無相關性。由于受到臨床樣本數量的限制，部分基因型研究對象數量相對較少，可能對統計分析結果的客觀性具有一定的影響，還需要擴大樣本量進一步研究。

綜上所述，PAX4基因 rs10229583位點和rs114202595位點單核苷酸多態性與妊娠期糖尿病發病相關，需要進一步研究以明確其發病機制。