淺論miR-135b和LZTS1在肺癌組織中的表達及其臨床意義

葉 巖，霍前倫，寧成棟

（六安市人民醫院心胸外科，安徽 六安 237016）

相關的調查數據顯示，在所有惡性腫瘤患者中，肺癌患者的發病率和死亡率均最高。進行外科手術是目前臨床上治療肺癌的主要手段。但是，TNM分期為I期且無淋巴結轉移的肺癌患者在接受開胸肺癌根治術或腔鏡下肺癌完全性切除術后，仍有25%～30%的患者會出現病情復發的情況[1]。因此，對肺癌的侵襲機制和轉移機制進行進一步的研究，尋找診斷及治療肺癌的有效靶點，對改善肺癌患者的預后具有重大意義。miR-135b（微小RNA-135b）是一類非編碼的、長度為19～22 nt的小分子RNA。目前，已發現miR-135b可參與機體的多種生理及病理活動，包括惡性腫瘤的發生與發展[2]。有學者發現，潛在的抑癌基因LZTS1（亮氨酸拉鏈腫瘤抑制基因1）在肺癌組織中存在異常表達的情況。本次研究主要是探討miR-135b和LZTS1在肺癌組織中的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究的對象為2014年3月至2017年6月期間81例原發性肺癌患者在六安市人民醫院進行手術治療時切取的81對肺癌組織及癌旁組織的存檔組織蠟塊標本。本研究中患者的納入標準是：1）患者的病情經病理檢查后，被確診為原發性肺癌。2）患者的臨床病例資料完整。3）患者的組織蠟塊標本保存完好。其排除標準是：1）患者合并有其他惡性腫瘤。2）患者合并有可影響對其組織標本進行染色的嚴重疾病。在這81例患者中，有男性52例，女性29例；其中年齡＜60歲的患者有37例，年齡≥60歲的患者有44例；其中肺鱗癌患者有50例，肺腺癌患者有31例；其中肺癌分化程度為高分化的患者、為中分化的患者和為低分化的患者分別有35例、41例和5例；其中TNM分期為Ⅰ期的患者、為ⅡA期的患者、為ⅡB期的患者和為Ⅲ期的患者分別有3例、49例、21例和8例；其中無淋巴結轉移的患者有26例，出現淋巴結轉移的患者有55例。本次研究獲得了六安市人民醫院醫學倫理委員會的批準。

1.2 研究方法

對這81對組織蠟塊標本均進行miR-135b和LZTS1檢測，方法是：1）使用LNA-ISH法檢測組織標本中miR-135b的表達。對組織蠟塊標本進行常規的切片、烤片、脫蠟、水化處理后，加入蛋白酶K緩沖溶液以暴露其中的RNA，用PBS溶液洗滌2次，每次洗30 s，用甲醛固定后將其切片，再用PBS溶液洗滌2次，每次洗5 min。將處理后的組織標本放入55℃的雜交緩沖液中預孵育2 h，加入含探針（由丹麥的EXIQON公司定制合成）的雜交緩沖液后將其放入55℃的恒溫水浴箱中孵育過夜。對孵育后的組織標本進行洗滌后將其切片，然后使用NBT/BCIP法對切片進行顯色，并用核固紅染液對切片進行復染。對染色后的切片進行常規梯度酒精脫水和中性樹膠封片。2）使用免疫組化法檢測組織蠟塊標本中LZTS1蛋白的表達。對組織蠟塊標本進行常規的切片、烤片、脫蠟、水化處理后，將其放入枸櫞酸鹽抗原修復液中進行高溫高壓修復抗原4 min，用PBS溶液洗滌2次，每次洗5 min，滴加H2O2覆蓋切片（以阻斷內源性過氧化物酶），用PBS溶液洗滌2次，每次洗5 min。將切片放入封閉用山羊血清（通用型SP試劑盒試劑A）中進行室溫孵育30 min，滴加一抗LZTS1兔抗人多克隆抗體后在4℃的溫度下孵育過夜，將其滴加二抗生物素工作液（通用型SP試劑盒試劑B）后在常溫下孵育30 min，用PBS溶液洗滌2次，每次洗5 min。在切片中滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液（通用型SP試劑盒試劑C），將其在37℃的溫度下孵育30 min，用PBS溶液洗滌2次，每次洗5 min。用DAB顯色液對切片進行顯色后，用蘇木素對其進行復染，然后用自來水對其進行沖洗反藍處理。對染色后的切片進行常規的梯度酒精脫水和中性樹膠封片。3）對切片的染色結果進行判定的方法是：在高倍光學顯微鏡下選取5個視野對切片進行觀察。每個視野至少含有100個細胞，miR-135b以藍色或藍紫色顆粒為陽性信號，LZTS1以黃色或黃棕色顆粒為陽性信號。對切片染色結果進行評分的標準是：⑴染色強度的計分標準是：無染色計為0分，淺色計為1分，淺色至中等染色計為2分，深度染色計為3分。⑵染色數目的計分標準是：染色細胞數＜5%計為0分，染色細胞數為5%～25%計為1分，染色細胞數為26%～50%計為2分，染色細胞數為51%～75%計為3分，染色細胞數＞75%計為4分。各視野染色的評分＝染色強度計分×染色數目計分，將各視野評分的算術平均數作為最終評分。評分≤2分視為陰性表達，評分＞2分則視為陽性表達。然后，對這81對標本的檢測結果和標本所涉及患者的臨床資料進行回顧性研究，從中找出肺癌組織中的miR-135b表達和LZTS1表達與患者臨床特征的相關性。

1.3 統計學方法

將本次研究中的數據錄入到SPSS22.0軟件中進行處理，計數資料組間比較采用χ2檢驗，相關性檢驗采用Spearman等級檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌組織標本與肺癌旁組織標本中miR-135b和LZTS1的陽性表達率

在本研究的81對組織標本中，肺癌組織標本中miR-135b的陽性表達率為66.67%（54/81），癌旁組織標本中的miR-135b的陽性表達率為40.74%(33/81)；肺癌組織標本中miR-135b的陽性表達率高于癌旁組織標本中的miR-135b的陽性表達率，P＜0.05。肺癌組織標本中LZTS1的陽性表達率為37.04%（30/81），癌旁組織標本中LZTS1的陽性表達率為66.67%（54/81）；肺癌組織標本中LZTS1的陽性表達率低于癌旁組織標本中LZTS1的陽性表達率，P＜0.05。

2.2 肺癌患者的臨床特征與其肺癌組織中miR-135b的表達和LZTS1的表達的關系

在這81例患者中，肺癌組織的病理分化程度、TNM分期和是否出現淋巴結轉移與其肺癌組織中miR-135b的陽性表達和LZTS1的陽性表達均密切相關，P＜0.05。詳見表1。

表1 肺癌患者的臨床特征與其肺癌組織中miR-135b的表達和LZTS1的表達的關系[n(%)]

2.3 肺癌組織標本中miR-135b的陽性表達與其中LZTS1的陽性表達之間的關系

對這81對肺癌組織標本的檢查結果進行Spearman等級檢驗的結果顯示，肺癌組織標本中miR-135b的表達與LZTS1 的表達呈負相關（r=-0.651，P=0.000）。

3 討論

近年來，隨著分子檢測技術的逐漸成熟，研究人員對microRNAs等基因功能的研究也逐漸深入。microRNAs雖然屬于不編碼蛋白質，但其可通過與靶基因mRNA 的3’UTR互補配對抑制蛋白質的翻譯功能或直接降解mRNA，起到對靶基因的負性調控功能。microRNAs可廣泛地參與機體細胞的各種生理進程（包括細胞的增殖、凋亡、分化與發育）。有研究表明，肺癌的發生、惡性進展的過程均與microRNAs的異常表達密切相關[3]。miR-135b是近期內新發現的一種促癌基因。IS Fetahu等[4]的研究發現，miR-135b能夠與miR-146b協同抑制鈣敏感受體，促進結腸癌細胞和直腸癌細胞的增殖，抑制結腸癌細胞和直腸癌細胞的分化，增加結腸癌細胞和直腸癌細胞的侵襲力。張學軍等[5]的研究發現，長鏈非編碼RNA GAS5對非小細胞肺癌的抗腫瘤作用是抑制肺癌組織中miR-135b的表達，增加癌細胞對放療的敏感性，抑制癌細胞的代謝，進而起到抑癌基因樣作用。黃媛[6]的研究發現，在人體黏液樣脂肪肉瘤中miR-135b的表達上升，具有促進腫瘤惡性進展的作用。本研究發現，miR-135b在肺癌組織標本中呈異常高表達狀態，而且miR-135b的表達情況與患者肺癌組織的分化程度、TNM分期、是否發生淋巴結轉移等均密切相關。這說明，miR-135b在肺癌組織中同樣呈現出促癌基因樣作用，并且可能參與抑制癌細胞分化及促進癌細胞轉移等過程。LZTS1是Ishii等在1999年由8p22基因克隆出的一種抑癌基因。大量的研究表明，LZTS1可表現出抑癌基因樣作用。阮國棟[7]的研究表明，多種胃癌細胞中LZTS1的表達異常降低，而且缺失LZTS1的胃癌細胞可呈現出低分化、高侵襲力的傾向。Ishii等[8]的研究結果顯示，LZTS1對腫瘤細胞的抑制作用是通過調控細胞的有絲分裂來實現的。周薇[9]的研究發現，LZTS1可通過抑制AKT-mTOR的信號通路抑制結腸癌細胞和直腸癌細胞的增殖與分化。李偉東等[10]的研究發現，通過乳腺癌組織中LZTS1的表達缺失可推測出乳腺癌的發生可能與LZTS1的表達缺失有關。本研究發現，肺癌組織標本中LZTS1的表達異常降低，且與患者肺癌組織的分化程度、TNM分期、是否發生淋巴結轉移密切相關。這說明，肺癌的產生、惡性進展均與患者機體內LZTS1的表達受到抑制有關。張彥兵等[11]通過體外研究發現，在肝癌細胞中，miR-135b對肝癌細胞的侵襲與轉移的促進作用均是通過抑制LZTS1的表達來實現的，因此肝癌組織中miR-135b的表達與LZTS1的表達呈顯著的負相關。本研究發現，肺癌組織標本中miR-135b的表達與LZTS1的表達呈顯著的負相關。這說明，miR-135b、LZTS1可在肺癌的產生、惡性進展的過程中起到相互拮抗的作用。

綜上所述，肺癌組織中miR-135b的表達明顯升高，其中LZTS1的表達則明顯降低，miR-135b可能通過下調LZTS1參與肺癌的發生與發展。