絞股藍皂苷類成分的超高效液相色譜指紋圖譜研究

黃盼盼 ，馬臨科 ，唐登峰 ，趙維良 △

（1.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053； 2.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310052）

絞股藍Gynostemma pentaphylum（Thunb.）Mak.是葫蘆科Cucurbitaceae絞股藍屬Gynostemma的干燥地上部分，產于我國陜西南部和長江以南各省區，生于山坡疏林、灌叢中或路旁草叢中，本種入藥，有消炎解毒、止咳祛痰的功效［1］。其藥用成分主要為皂苷類和黃酮類物質，以及氨基酸和多糖類等成分，其中絞股藍皂苷有抗疲勞、促進細胞新陳代謝、增強免疫力等多種生理活性［2-5］。目前，關于絞股藍藥材皂苷類物質的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜尚未見報道。本研究中建立了UPLC絞股藍皂苷類物質的指紋圖譜，并對浙江、四川、陜西和湖南4個產地的絞股藍藥材進行比較分析，為絞股藍藥材及其飲片的質量控制提供了科學依據，同時為其產地研究提供了研究思路。

1 儀器與試藥

儀器：ACQUITY H-Class型超高效液相色譜儀（包括四元溶劑管理器、PDA檢測器，上海沃特世科技公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水機（美國Millipore公司）；Elmasonic P 300型超聲波清洗器（德國Elma公司）；XPE205型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；Minispin 12 000轉離心機（德國Eppendorf公司）。

試藥：絞股藍藥材購于浙江武義壽仙谷藥業有限公司提供，經浙江省食品藥品檢驗研究院主任中藥師郭增喜鑒定為葫蘆科植物絞股藍Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Mak.的干燥地上部分，采收于2017年7月或9月（S2于9月），詳見表1。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，均購于Merck公司；水為超純水。

表1 絞股藍藥材來源

2 方法與結果

2.1 UPLC 分析

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫，程序見表 2；流速：0.2 mL ／min；檢測波長：203 nm，柱溫：30℃；進樣量：2 μL。吸取S3批制備的供試品溶液2 μL，按上述色譜條件進樣分析，色譜圖見圖1。

表2 流動相梯度洗脫表

圖1 超高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

取絞股藍干燥地上部分粉末（過4號篩）1.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，超聲處理（功率 250 W，80 kHz）30 min，放置至室溫，用 70%甲醇補足丟失質量，取2 mL供試品上清液，以轉速為13 000 r／min 離心 5 min，取上清液用 0.22 μm 微孔過濾，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

精密度試驗：精密吸取S3批供試品溶液，按照2.1項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖，選取S峰作為參照峰，計算其他特征峰的相對保留時間和相對峰面積。結果各特征峰相對保留時間的RSD為0.23%（n＝6），相對峰面積的RSD為2.12%（n＝6），表明該方法精密度良好，符合指紋圖譜技術要求。

穩定性試驗：吸取S3批供試品溶液，按擬訂色譜條件在 0，2，4，8，12，24 h 時進樣，以 S 峰作為參照峰計算其他特征峰的相對保留時間和相對峰面積。結果各特征峰相對保留時間的RSD為1.01%（n＝6），相對峰面積的RSD為1.43%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取S3批絞股藍藥材，依法制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖。結果各特征峰的相對保留時間的RSD為0.10%（n＝6），相對峰面積的RSD為 1.29%（n＝6），表明該方法重復性良好，符合指紋圖譜技術要求。

2.2 指紋圖譜分析

皂苷類成分指紋圖譜的建立：取S1-S16批樣品，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，按照擬訂色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，將所得色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版（以下簡稱2012年版評價系統）進行分析，選擇S1批絞股藍藥材作為參照圖譜，其指紋圖譜見圖2。根據以上分析結果，取S1-S10批絞股藍藥材作為模板藥材建立指紋圖譜，選擇S1批作為參照圖譜，進行峰匹配，建立的指紋圖譜見圖3，多點校正后經自動匹配生成的對照指紋圖譜見圖4。

圖2 16批樣品指紋圖譜

圖3 S1-S10批指紋圖譜

圖4 S1-S10批對照指紋圖譜

特征指紋峰的標定：根據相對保留時間標定特征指紋峰，對模板S1-S10批絞股藍UPLC測定結果進行比較，發現9個特征峰為S1-S10批絞股藍藥材共有的，因此確定這9個峰為特征指紋峰，計算其他特征峰的相對保留時間和相對峰面積。結果見表3。

相似度評價：2012版評價系統中，對16批絞股藍藥材進行相似度評價分析，其中以S1-S10批作為模板藥材建立指紋圖譜，生成對照圖譜并進行相似度評價，采用S1批樣品色譜圖作為參照圖譜。其中，S1-S10批絞股藍藥材的UPLC指紋圖譜見圖3，多點校正后經自動匹配生成的對照指紋圖譜見圖4。結果16批絞股藍藥材相對于對照圖譜的相似度見表4。

表3 S1-S10批絞股藍指紋圖譜中共有特征峰相對保留時間及相對峰面積

表4 絞股藍指紋圖譜相似度結果

3 討論

3.1 UPLC分析優勢

絞股藍藥材皂苷類成分復雜，HPLC分析需要較長的分析時間（70 ～80 min）才能獲得較理想的分離效果［5］。UPLC分析僅需30 min且分離情況理想，在填補了UPLC建立絞股藍藥材指紋圖譜的空白的同時，分離效果上也比已報道絞股藍藥材的研究有了提高［6］。

3.2 色譜條件考察

考察了不同濃度溶劑甲醇（50%，70%）、不同溶劑體積（25 mL和50 mL）、不同提取方法（超聲、回流）和提取時間（30 min，45 min，60 min）的影響［7-8］，結果以25 mL甲醇超聲提取30min的提取效果最好。

考察不同流動相系統（甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸、甲醇 -0.1 磷酸、乙腈 -水、乙腈 -0.4% 磷酸、乙腈-0.1%磷酸）、檢測波長（203 nm和254 nm）和不同流速的影響。結果顯示，乙腈-水的洗脫能力較強且分離度、峰形較好，檢測波長為203 nm，柱溫為30℃，流速為0.2 mL／min時，色譜峰基線平穩、分離度好，可更好分離絞股藍皂苷各成分，因此采用梯度洗脫方式進行分析。

3.3 不同產地絞股藍藥材相似度存在差異

浙江、四川和湖南綏寧縣鵝公嶺鄉的藥材相似度均在0.88以上，而陜西和湖南綏寧朝儀鄉的相似度較低，只有0.55～0.75，說明浙江產絞股藍和四川、湖南綏寧縣鵝公嶺鄉產絞股藍基本一致，而陜西和湖南綏寧朝儀鄉絞股藍相似度較低。絞股藍的產地差異不僅存在于省份之間，也存在于鄉鎮之間［9-14］。

3.4 研究價值

本研究中以UPLC技術建立的絞股藍藥材指紋圖譜，分離效果較好。對10批絞股藍藥材標定了9個共有峰，比較了浙江、陜西、四川和湖南4個產地絞股藍的差異，為絞股藍質量控制提供了科學依據。