激肽系統在ED大鼠模型陰莖組織中的表達變化研究*

王天宇 斯依提·阿木提 馬文靜 劉文娟 張盼盼 阿地力江·伊明**

1. 新疆醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室（烏魯木齊 830011）; 2. 新疆醫科大學中心實驗室

勃起功能障礙（ectile dysfunction，ED）是指陰莖持續不能達到或維持足夠的勃起以完成滿意的性生活，是影響男性健康的常見疾病之一，其發生的直接原因是陰莖海綿體平滑肌不能充分舒張，導致海綿體靜脈竇不能充分開放、充盈[1]。前期工作中，我們在對ED大鼠模型陰莖的蛋白質組學研究中發現T-激肽原顯著上調，可作為蛋白候選標志物，但其作用機制不詳。本研究是在此基礎上，對ED大鼠陰莖組織中激肽系統的表達改變進行進一步研究，探討ED發生發展與激肽釋放酶-激肽系統表達變化的關系，及藥物伊木薩克片可能的調控作用，現報道如下。

材料與方法

一、實驗動物

正常雄性SD大鼠120只，體質量（200±10）g，購自新疆醫科大學實驗動物中心。

二、主要實驗儀器

RXZ-436LD型人工氣候箱（寧波江南儀器廠），BS-1105 型電子天平（北京賽多科斯天平有限公司），Eppendorf PCR儀（德國Eppendorf公司）5810R型低溫離心機（德國Eppendorf公司），DYY-8C電泳儀（方正公司），微波爐（HEGON公司），GL-88B漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），低溫試劑柜（中科美菱），UVP凝膠成像儀（美國UVP公司），水平脫色搖床（金壇市成輝儀器廠），Proteinsimple Fluor Chem E 化學發光凝膠成像系統（美國Proteinsimple公司）。

三、主要試劑和藥物

阿樸嗎啡（Apomorphine,APO，美國Sigma公司，批號：SLBP2431V），伊木薩克片（新疆和田維吾爾藥業有限責任公司），miRneasy MiNi Kit試劑盒（德國QIAGEN公司，批號：154027952），M5 First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（北京聚合美公司，批號：20170308），2×Taq PCR Mastermix 試劑盒（北京天根生化有限公司，批號：Q5116），EB（北京天根生化有限公司），激肽釋放酶1兔多克隆抗體（Abcam公司），T-激肽原1鼠單克隆抗體（Cloud-Clone Corp 公司）， BCA蛋白定量試劑盒（北京聚合美公司），羊多克隆抗兔二抗（北京中杉金橋），羊多克隆抗鼠二抗（北京中杉金橋），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司），免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋公司）。

四、動物模型的建立與藥物干預

具有正常性功能的雄性SD大鼠120只，分為正常對照組20只（N組），余100只為造模組（M組），采用環境雌激素樣飲食聯合冷應激建立ED模型[2]。22周后，經性行為學實驗和APO陰莖勃起實驗篩選出ED模型組（ED組，56只），未成ED大鼠為復合應激組（S組，44只）。從S組與ED組中分別隨機抽出20只大鼠為應激用藥組（S-Y組，20只）和ED用藥組（ED-Y組，20只）。用藥組以伊木薩克片干預，每日1次，每次250mg/kg，干預時間為2周。戊巴比妥鈉麻醉后，大鼠取陰莖組織，-80℃保存。

五、RT-PCR

取50mg陰莖組織，按照miRNeasy Mini Kit試劑盒提取總RNA，Nanodrop 2000微量分光光度計測量總R N A濃度，按RT-P C R試劑盒說明書進行操作。引物序列：（1）β-actin（F 5'-TTGTAACCAACTGGGACGAT-3' R 5'-GCCAGCCAGGTCCAGACGCA-3' ）；（2）激肽釋放酶1（F 5'-TACTACTTCGGCGAATACCTA-3'R 5'-TCCAATCCGTCAGGTGTGATG-3'）；（3）T-激肽原（F 5'- GCTGGTGCGAGTACAAGAAA-3' R 5'- CTATGGTGTCACGGTTGAAG-3'）。循環參數：所有循環參數為94℃ 預變性3min；94℃ 變性30s；56℃ 退火30s；72℃延伸 1min；35個循環后，72℃延伸5min。瓊脂糖凝膠電泳：最終的PCR產物用加入EB的2%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用UVP凝膠成像系統成像，底片用Image J軟件進行分析。

六、Western-blot

用Western-blot方法檢測激肽釋放酶1、T-激肽原1的蛋白表達。利用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法蛋白定量算出各蛋白濃度，加Loading Buffer沸水煮10 min使蛋白變性后-20℃保存備用，避免反復凍融。配制5%濃縮膠、12%分離膠，上樣電泳2h，4℃恒壓濕性電轉2h。用含有TBST的5%脫脂牛奶封閉非特異性蛋白2h，加入一抗激肽釋放酶1（1：500）、T-激肽原1（1：500），4℃一抗孵育過夜。次日TBST清洗后室溫二抗孵育2 h，用1% TBST清洗ECL化學顯影并拍照。

七、免疫組化

取材后陰莖組織用4%甲醛固定，用石蠟包埋制成石蠟切片。運用免疫組化SP法進行檢測，按檢測試劑盒所示步驟進行。最終結果棕黃色胞核及淺黃色胞漿為陽性細胞，藍色胞核及無色胞漿為陰性細胞。在顯微鏡下（放大倍數400倍）計數陽性細胞，并按陽性范圍和著色強度的乘積進行評分并統計。

八、統計學分析

采用SPSS17.0統計軟件進行分析，計量資料用以均數±標準誤（±s）表示，多組數據做正態檢驗和方差齊性檢驗，滿足條件，采用單因素方差分析（ANOVA）；如不滿足條件，求出秩次進行方差分析，檢驗水準 α＝0.05 。P＜0.05有統計學差異。

結 果

一、T-激肽原1與激肽釋放酶1的轉錄水平變化

激肽釋放酶1在S組、ED組顯著下調，經藥物伊木薩克片干預后S-Y、ED-Y組顯著上調；T-激肽原在S組、ED組顯著上調，經藥物干預后S-Y、ED-Y組顯著下調，P＜0.05（見圖1、圖2）。

圖1 各組大鼠陰莖組織 T-激肽原1與激肽釋放酶1的mRNA表達變化

圖2 各組大鼠陰莖組織T-激肽原1與激肽釋放酶1的mRNA表達變化

二、T-激肽原1與激肽釋放酶1在陰莖組織的蛋白表達

激肽釋放酶1在S組、ED組顯著下調，經藥物伊木薩克片干預后S-Y、ED-Y組顯著上調；T-激肽原1在S組、ED-組顯著上調，經藥物干預后S-Y、ED-Y組顯著下調，P＜0.05（見圖3、圖4）。

圖3 各組大鼠陰莖組織 T-激肽原1與激肽釋放酶1的蛋白表達變化

圖4 各組大鼠陰莖組織 T-激肽原1與激肽釋放酶1的蛋白表達變化

三、免疫組化

免疫組化結果顯示激肽釋放酶1、T-激肽原1在大鼠陰莖組織尿道內皮、陰莖海綿體竇及血管內皮均有表達，與正常組相比，S組、ED組激肽釋放酶1表達顯著降低，經伊木薩克片干預后S-Y組、ED-Y組顯著升高；T-激肽原1在SED組與正常組相比表達顯著升高，經藥物干預后顯著降低（圖5，表1）。

圖5 各組大鼠陰莖組織免疫組化染色結果（×400）

表1 免疫組化檢測大鼠陰莖組織T-激肽原1 、激肽釋放酶1表達

討 論

陰莖是高度血管化的器官，任何正常內皮細胞功能的破壞都可能影響陰莖血流量并影響勃起功能，血管疾病是ED發展的重要基礎[3]。本課題前期研究發現在ED大鼠模型陰莖組織的HE染色結果顯示，間質纖維化明顯，伴有空泡樣改變，提示水腫明顯，組織中可能有炎性變化，并伴隨血管內皮功能損傷，血管內皮功能障礙則是導致ED的主要原因之一。激肽釋放酶-激肽系統是一個復雜的內源性多酶系統，調控心血管、神經系統等的生理功能，與心臟病、腦血管疾病、炎癥反應、腫瘤等疾病的發生有密切關系。包括激肽釋放酶原、激肽釋放酶、激肽原、激肽及其受體[5]。研究發現激肽系統與血管內皮功能相關，可以導致血管內皮增殖、炎癥反應等[5,6]，從而引起血管內皮功能障礙。

T-激肽原是一種血漿糖蛋白，首先在大鼠血清中被發現，認為是急性炎癥期的一種反應物，后來被發現是半胱氨酸蛋白酶抑制劑[7]。在大鼠中，有4種類型的激肽原，其中兩種是經典的高分子量和低分子量的激肽原，其余兩種是低分子量的激肽原，稱為“第三”激肽原，命名為T-激肽原1和T-激肽原2，T-激肽原是大鼠中特有的[8]。我們在前期通過同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術結合液相二級質譜（LC-MS-MS）研究了ED大鼠模型，并獲得大鼠血清候選差異蛋白，其T-激肽原在ED大鼠血清中顯著上調。但T-激肽原在陰莖勃起過程中和ED發生發展中可能的作用尚不清楚。本研究顯示，S組與ED組大鼠模型陰莖組織中T-激肽原1表達較N組顯著增高，較S組而言ED組有增長的趨勢；免疫組化結果顯示T-激肽原1在海綿竇與血管內皮表達豐富，且S組與ED組表達量顯著高于N組，提示T-激肽原1可能通過血管內皮增殖或炎癥等反應影響內皮細胞功能并在ED發生發展過程中發揮關鍵作用，經藥物干預后S-Y、ED-Y組大鼠T-激肽原1表達顯著降低，提示伊木薩克片可能通過下調T-激肽原1的表達，對ED大鼠模型發揮治療作用。

激肽釋放酶分為血漿型激肽釋放酶和組織型激肽釋放酶（kallikrein, KLK），組織激肽釋放酶1，屬于絲氨酸蛋白酶家族，是負責激肽的產生。組織激肽釋放酶裂解成低分子量激肽原從而產生血管活性肽，其通過激肽受體發揮生物學功能[9]。KLK1已被證實對陰莖海綿體平滑肌有較強的舒張效應，并且有擴張血管保護血管內皮的功能[10]。研究發現在老年ED大 鼠中KLK1表達下降，KLK1通過抑制Ras同源類似物A（RhoA ）和Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶1（ROCK1）/LIM激酶2（LIMK2）/絲切蛋白（cofilin）通路的激活，改善海綿體纖維化，保持完整性和效率，最終保護老年大鼠的勃起功能[11]。進一步的研究表明，增強KLK1的表達可以調節二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）/非對稱性二甲基精氨酸（ADMA）/一氧化氮/環磷酸鳥苷（cGMP）和血小板環氧化物酶2（COX-2）、 前列腺素合酶（PTGIS）/環磷酸腺苷（cAMP）途徑，增加cGMP和cAMP的產生，從而改善老年性ED[12]。本研究結果發現，S組、ED組大鼠陰莖組織中KLK1表達較N 組顯著降低，提示KLK1表達降低可能導致降低對平滑肌的舒張效應，并影響血管內皮功能從而導致ED的產生。而經藥物干預后顯著升高，與N組無顯著差異，說明伊木薩克片可能通過上調KLK1的表達，從而對ED大鼠模型發揮作用。同時，我們在另一項研究中發現ED大鼠陰莖組織中RhoA/ROCK1通路發生了改變，且大鼠陰莖組織中RhoA、ROCK1的表達顯著升高。結合本研究結果，我們認為，KLK1表達改變可能在ED發生發展過程中發揮了關鍵性的作用，并和RhoA通路改變存在著內在的關系。

綜上所述，該ED大鼠模型中激肽釋放酶1表達顯著降低，T-激肽原表達顯著升高，可能是該ED發生發展的機制之一。而激肽系統在該ED發生、發展中的具體機制還有待進一步研究。